【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一種非編碼的短鏈RNA。可通過與靶基因mRNA互補結合,抑制mRNA的轉錄過程或直接降解與之結合的mRNA,發(fā)揮對mRNA轉錄后調控的作用。miRNA在多種組織和器官的發(fā)育與代謝中發(fā)揮調節(jié)功能,miRNA也可以通過介導靶基因的表達,調控前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化過程,介導脂質積累和代謝等生理過程。前期研究主要集中于miRNA對模式生物脂肪細胞調控的研究,對于miRNA在綿羊脂肪組織中的調控作用不甚了解。研究miRNA在綿羊脂肪細胞分化和脂質積累中的功能和分子機制可對改善綿羊脂肪分布、提高胴體品質奠定理論基礎。為探究miRNA對綿羊脂肪發(fā)育的影響,本研究首先利用高通量測序技術,對山西肉用綿羊母本品系(Shanxi Meat Sheep Dam Line,SMD)和小尾寒羊(Small Tailed Han STH)皮下脂肪組織的miRNA表達進行檢測。使用熒光定量PCR技術驗證測序數(shù)據(jù)的準確性。通過生物信息學方法識別在測序樣品中表達的已知miRNA和未知miRNA,隨后分析這些miRNA在STH和SMD測序文庫中的差異表達特征。使用靶基因預測軟件預測兩文庫中差異表達的miRNA的靶基因,使用Gene Ontology和KEGG數(shù)據(jù)庫對靶基因的潛在作用進行富集分析。挑選在兩文庫中高表達且表達存在顯著差異性的miR-124-3p作為研究對象,在細胞水平觀察miR-124-3p對脂肪源前體脂肪細胞和肌肉源前體脂肪細胞分化的影響。為驗證miR-124-3p與潛在靶基因C/EBPα和BCKDHA的結合情況,構建了這兩個基因mRNA3,-UTR的雙熒光報告載體,在293T細胞中觀察miR-124-3p對熒光報告載體熒光活性的影響。此外,還構建了BCKDH 過表達和沉默表達質粒,使用慢病毒包裝的方法構建慢病毒干擾表達系統(tǒng)。通過在肌肉源前體脂肪細胞中過表達或抑制表達BCKDHA,對支鏈氨基酸代謝關鍵基因BCKDHA在脂肪生成和支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)代謝中的功能進行了探究。本研究的主要結果如下:(1)通過對兩品種(系)綿羊皮下脂肪組織中miRNA表達量進行高通量測序,分別在小尾寒羊和山西肉用綿羊母本品系皮下脂肪中檢測到11264198和14715022條clean reads。隨后將clean reads比對到NCBI和miRBase數(shù)據(jù)庫,分別在兩個測序文庫中識別出121種和119種已知miRNA,以及163種和184種未知miRNA。對miRNA的表達進行差異分析后,發(fā)現(xiàn)有43種已知miRNA和117種未知miRNA在STH和SMD測序文庫之間顯著差異表達。對兩文庫中差異表達的已知miRNA和未知miRNA分別進行靶基因預測,發(fā)現(xiàn)這些已知miRNA存在297964個潛在靶基因,未知miRNA存在425278個潛在靶基因。隨后對兩品種(系)綿羊皮下脂肪組織中的miR-103、miR-107、miR-124-3p、miR-191、miR-221、novel-miR-42 和 novel-miR-121 進行熒光定量 PCR 檢測,驗證此次miRNA-seq檢測結果的準確性。發(fā)現(xiàn)經(jīng)熒光定量PCR技術檢測的七個miRNA的表達趨勢與高通量測序結果一致,說明本次高通量測序結果較為可靠。(2)基于上述高通量測序數(shù)據(jù),從中挑選出在兩文庫中表達量較高且表達存在顯著差異的miR-124-3p,對其在脂肪細胞分化過程中的作用進行了研究,并探討了miR-124-3p對成脂相關信號通路的影響。通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)C/EBPα和BCKDHA mRNA3'-UTR存在miR-124-3p的結合位點。經(jīng)過雙熒光報告技術表明miR-124-3p可顯著降低含有3'-UTR的雙熒光報告載體的熒光強度。在體外分離培養(yǎng)綿羊脂肪源和肌肉源前體脂肪細胞,在這兩種前體脂肪細胞中過表達或沉默表達miR-124-3p,并對細胞誘導分化,發(fā)現(xiàn)miR-124-3p的過表達抑制了這兩種前體脂肪細胞的分化,表現(xiàn)為脂滴形成減少,同時兩個潛在靶基因C/EBPα和BCKDHA在mRNA水平和蛋白水平表達量均顯著下調,且脂肪分化標志基因的表達量降低。miR-124-3p表達沉默的細胞則呈現(xiàn)相反的結果。(3)通過構建BCKDHA基因的慢病毒過表達和沉默表達系統(tǒng),在肌肉源前體脂肪細胞中過表達或沉默BCKDHA,并誘導細胞進行分化。發(fā)現(xiàn)過表達BCKDHA后,細胞分化能力增強,從細胞培養(yǎng)液中攝入支鏈氨基酸的速率提高,且分化標志蛋白的表達量上調。沉默表達BCKDHA后各項指標與過表達相反。說明BCKDH4可通過調控支鏈氨基酸的代謝,對綿羊肌肉源前體脂肪細胞的分化產生促進作用,本研究通過對綿羊皮下脂肪組織中miRNA表達譜的分析,尋找對綿羊脂肪代謝具有潛在調控功能的miRNA。對miR-124-3p在皮下脂肪和肌內脂肪形成中的功能進行了體外驗證,并對其作用機理進行了研究。本研究可為理解miRNA在不同部位脂肪組織形成中的功能提供參考,為減少綿羊皮下脂肪、增加肌內脂肪提供科學依據(jù)。
【圖文】：

ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊復合體，其中一條序列可以被ＲＮＡ誘導沉默復合體（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ逡逑ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｃｏｍｐｌｅｘ．邋ＲＩＳＣ）識別并成為其中一部分，，使ＲＩＳＣ具備特異性結合到基因ｍＲＮＡ逡逑的功能，而沒有被ＲＩＳＣ識別的另一條序列則經(jīng)歷降解的過程（圖１－２）。逡逑Ｉ邋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邐Ｃ邋ｊ逡逑%煎澹媯潁錚礤澹埃危鈴義瞎悖校潁浚恚歟遙危鈴義希ā掊危蓿模潁錚螅瑁徨澹校體義希祝恚椋遙危鈴巍蹂危穡潁錚恪澹睿玨澹義希危酰悖歟澹酰簀危儒危儒危懾義襄五五五危殄五義希茫簦錚穡歟幔螅礤危駑澹╁危義�？邋＾邋Ｅｘ７w錚潁簦歟睿靛義希徨逡唬義希裕裕裕埃保罷坼義希恚跡遙危粒海恚歟遙危粒澹洌酰穡歟澹謇镥澹懾澹懾危穡

本文編號：2665773