【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一種非編碼的短鏈RNA�？赏ㄟ^與靶基因mRNA互補(bǔ)結(jié)合,抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄過程或直接降解與之結(jié)合的mRNA,發(fā)揮對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。miRNA在多種組織和器官的發(fā)育與代謝中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能,miRNA也可以通過介導(dǎo)靶基因的表達(dá),調(diào)控前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化過程,介導(dǎo)脂質(zhì)積累和代謝等生理過程。前期研究主要集中于miRNA對(duì)模式生物脂肪細(xì)胞調(diào)控的研究,對(duì)于miRNA在綿羊脂肪組織中的調(diào)控作用不甚了解。研究miRNA在綿羊脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)積累中的功能和分子機(jī)制可對(duì)改善綿羊脂肪分布、提高胴體品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。為探究miRNA對(duì)綿羊脂肪發(fā)育的影響,本研究首先利用高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)山西肉用綿羊母本品系(Shanxi Meat Sheep Dam Line,SMD)和小尾寒羊(Small Tailed Han STH)皮下脂肪組織的miRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。使用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。通過生物信息學(xué)方法識(shí)別在測(cè)序樣品中表達(dá)的已知miRNA和未知miRNA,隨后分析這些miRNA在STH和SMD測(cè)序文庫中的差異表達(dá)特征。使用靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)兩文庫中差異表達(dá)的miRNA的靶基因,使用Gene Ontology和KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)靶基因的潛在作用進(jìn)行富集分析。挑選在兩文庫中高表達(dá)且表達(dá)存在顯著差異性的miR-124-3p作為研究對(duì)象,在細(xì)胞水平觀察miR-124-3p對(duì)脂肪源前體脂肪細(xì)胞和肌肉源前體脂肪細(xì)胞分化的影響。為驗(yàn)證miR-124-3p與潛在靶基因C/EBPα和BCKDHA的結(jié)合情況,構(gòu)建了這兩個(gè)基因mRNA3,-UTR的雙熒光報(bào)告載體,在293T細(xì)胞中觀察miR-124-3p對(duì)熒光報(bào)告載體熒光活性的影響。此外,還構(gòu)建了BCKDH 過表達(dá)和沉默表達(dá)質(zhì)粒,使用慢病毒包裝的方法構(gòu)建慢病毒干擾表達(dá)系統(tǒng)。通過在肌肉源前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)或抑制表達(dá)BCKDHA,對(duì)支鏈氨基酸代謝關(guān)鍵基因BCKDHA在脂肪生成和支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)代謝中的功能進(jìn)行了探究。本研究的主要結(jié)果如下:(1)通過對(duì)兩品種(系)綿羊皮下脂肪組織中miRNA表達(dá)量進(jìn)行高通量測(cè)序,分別在小尾寒羊和山西肉用綿羊母本品系皮下脂肪中檢測(cè)到11264198和14715022條clean reads。隨后將clean reads比對(duì)到NCBI和miRBase數(shù)據(jù)庫,分別在兩個(gè)測(cè)序文庫中識(shí)別出121種和119種已知miRNA,以及163種和184種未知miRNA。對(duì)miRNA的表達(dá)進(jìn)行差異分析后,發(fā)現(xiàn)有43種已知miRNA和117種未知miRNA在STH和SMD測(cè)序文庫之間顯著差異表達(dá)。對(duì)兩文庫中差異表達(dá)的已知miRNA和未知miRNA分別進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)這些已知miRNA存在297964個(gè)潛在靶基因,未知miRNA存在425278個(gè)潛在靶基因。隨后對(duì)兩品種(系)綿羊皮下脂肪組織中的miR-103、miR-107、miR-124-3p、miR-191、miR-221、novel-miR-42 和 novel-miR-121 進(jìn)行熒光定量 PCR 檢測(cè),驗(yàn)證此次miRNA-seq檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。發(fā)現(xiàn)經(jīng)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)的七個(gè)miRNA的表達(dá)趨勢(shì)與高通量測(cè)序結(jié)果一致,說明本次高通量測(cè)序結(jié)果較為可靠。(2)基于上述高通量測(cè)序數(shù)據(jù),從中挑選出在兩文庫中表達(dá)量較高且表達(dá)存在顯著差異的miR-124-3p,對(duì)其在脂肪細(xì)胞分化過程中的作用進(jìn)行了研究,并探討了miR-124-3p對(duì)成脂相關(guān)信號(hào)通路的影響。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)C/EBPα和BCKDHA mRNA3'-UTR存在miR-124-3p的結(jié)合位點(diǎn)。經(jīng)過雙熒光報(bào)告技術(shù)表明miR-124-3p可顯著降低含有3'-UTR的雙熒光報(bào)告載體的熒光強(qiáng)度。在體外分離培養(yǎng)綿羊脂肪源和肌肉源前體脂肪細(xì)胞,在這兩種前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)或沉默表達(dá)miR-124-3p,并對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化,發(fā)現(xiàn)miR-124-3p的過表達(dá)抑制了這兩種前體脂肪細(xì)胞的分化,表現(xiàn)為脂滴形成減少,同時(shí)兩個(gè)潛在靶基因C/EBPα和BCKDHA在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)量均顯著下調(diào),且脂肪分化標(biāo)志基因的表達(dá)量降低。miR-124-3p表達(dá)沉默的細(xì)胞則呈現(xiàn)相反的結(jié)果。(3)通過構(gòu)建BCKDHA基因的慢病毒過表達(dá)和沉默表達(dá)系統(tǒng),在肌肉源前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)或沉默BCKDHA,并誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行分化。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BCKDHA后,細(xì)胞分化能力增強(qiáng),從細(xì)胞培養(yǎng)液中攝入支鏈氨基酸的速率提高,且分化標(biāo)志蛋白的表達(dá)量上調(diào)。沉默表達(dá)BCKDHA后各項(xiàng)指標(biāo)與過表達(dá)相反。說明BCKDH4可通過調(diào)控支鏈氨基酸的代謝,對(duì)綿羊肌肉源前體脂肪細(xì)胞的分化產(chǎn)生促進(jìn)作用,本研究通過對(duì)綿羊皮下脂肪組織中miRNA表達(dá)譜的分析,尋找對(duì)綿羊脂肪代謝具有潛在調(diào)控功能的miRNA。對(duì)miR-124-3p在皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪形成中的功能進(jìn)行了體外驗(yàn)證,并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了研究。本研究可為理解miRNA在不同部位脂肪組織形成中的功能提供參考,為減少綿羊皮下脂肪、增加肌內(nèi)脂肪提供科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊復(fù)合體，其中一條序列可以被ＲＮＡ誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ逡逑ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｃｏｍｐｌｅｘ．邋ＲＩＳＣ）識(shí)別并成為其中一部分，，使ＲＩＳＣ具備特異性結(jié)合到基因ｍＲＮＡ逡逑的功能，而沒有被ＲＩＳＣ識(shí)別的另一條序列則經(jīng)歷降解的過程（圖１－２）。逡逑Ｉ邋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邐Ｃ邋ｊ逡逑%煎澹媯潁錚礤澹埃危鈴義瞎悖校潁浚恚歟遙危鈴義希ā掊危蓿模潁錚螅瑁徨澹校體義希祝恚椋遙危鈴巍蹂危穡潁錚恪澹睿玨澹義希危酰悖歟澹酰簀危儒危儒危懾義襄五五五危殄五義希茫簦錚穡歟幔螅礤危駑澹╁危義�？邋＾邋Ｅｘ７w錚潁簦歟睿靛義希徨逡唬義希裕裕裕埃保罷坼義希恚跡遙危粒海恚歟遙危粒澹洌酰穡歟澹謇镥澹懾澹懾危穡

本文編號(hào)：2665773