【摘要】：犬冠狀病毒(Canine coronavirus,CCoV)是小腸的自限性病原體,一般會導(dǎo)致幼齡犬非致死性的輕度腹瀉,當(dāng)與其他腸道病原體共感染時,患病動物死亡率升高。1971年CCoV首次在德國報道,目前呈世界性流行。近年來,隨著歐洲地區(qū)多例致死性的CCoV高致病性變異毒株的報道,引起全球研究學(xué)者的普遍關(guān)注。本試驗旨在對從北京地區(qū)采集到的犬糞便樣品進(jìn)行檢測,并對部分陽性樣品進(jìn)行病毒分離,經(jīng)鑒定確實為CCoV,之后用分離的病毒建立用于CCoV檢測的SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR方法和鑒別CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ的雙重納米RT-PCR方法,以期可以深入了解北京地區(qū)CCoV的流行情況,為犬冠狀病毒病的診斷、防治及后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。用優(yōu)化后的RT-PCR法對采集于北京地區(qū)犬糞便樣本進(jìn)行犬冠狀病毒檢測及基因型鑒定,從檢測的陽性樣本中篩選出病毒粒子濃度高且無其他犬常見病毒感染的3個樣品進(jìn)行CCoV的分離。2份樣品在增殖至4代前CPE明顯,通過RT-PCR法顯示為陽性,至第5、6代CPE不明顯甚至消失,RT-PCR法結(jié)果顯示為陰性,另外1份樣品成功分離,說明CCoV在細(xì)胞上能出現(xiàn)CPE,但是病毒增殖較不穩(wěn)定。應(yīng)用參考毒株的多抗對分離毒進(jìn)行了間接免疫熒光試驗,并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定,確定該病毒為CCoV,經(jīng)RT-PCR法鑒定其基因型為Ⅱ型。對CCoV分離株C-末端9 kb的基因片段進(jìn)行克隆并測序,通過與Gen Bank中提供的其他CCoV基因組比對,結(jié)果顯示與CCoVfc1株有最高同源性,屬于CCoVⅡ型的分支中,與國內(nèi)的分離株同源性也很高,說明國內(nèi)CCo V在進(jìn)化上很可能存在共同的來源,與CCo V-Ⅰ型的23/03株同源性最低,之后在NCBI中進(jìn)行BLAST發(fā)現(xiàn)與意大利的CCoV strain 430/07株同源性最高,高達(dá)約96%。應(yīng)用分離的病毒建立了快速檢測CCoV的SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR方法,最低能檢測出45copies,應(yīng)用該方法對采集北京地區(qū)的某犬養(yǎng)殖場和動物醫(yī)院共計76份糞便樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果揭示,集約型養(yǎng)殖很容易導(dǎo)致整個犬群CCoV的傳播流行。同時建立了用于鑒別CCoV-Ⅰ和CCo V-Ⅱ的雙重納米RT-PCR方法,具有良好的特異性和靈敏性,并且操作簡便快捷,靈敏性試驗表明最低核酸檢測量是普通RT-PCR方法的100倍。用雙重納米RT-PCR方法對采集于北京地區(qū)的60份糞便樣本進(jìn)行檢測,結(jié)果可知CCoV-Ⅱ型在犬群中的感染率較大,相比較CCoV-Ⅰ而言占優(yōu)勢,并且結(jié)果顯示犬群中存在兩種基因型共感染的情況。
【圖文】：

結(jié)構(gòu)基因組是一段連續(xù)的單鏈正股 RNA，是一個多順反子，大小A 病毒中基因組最大的（Lai et al., 1997）。CCoV 基因組 RNA 構(gòu)（cap）和多聚 A 尾，從 5' 端到 3' 端包含 10 個開放性閱讀框ose et al., 2012）。5'端為兩個重疊的開放閱讀框 ORF1a（12354病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的 RNA 依賴的 RNA 聚合酶和蛋白酶，其 1/3，從 5' ~3' 端依次為 S（4362 bp），ORF3a（213 bp），ORFE（246 bp），M（798 bp），N（1203 bp），ORF7a（303bp）關(guān)振宏，，2004; Decaro N et al., 2015）。其中 ORF3a、ORF3b 和 S 相鄰，其余各 ORF 間由內(nèi)含子分隔開。圖 1.1 CCoV 的結(jié)構(gòu)模式圖（王欣宇, 2017）Fig. 1.1 The model diagram of CCoV (Wang Xinyu, 2017)

1.1.4 基因組結(jié)構(gòu)CCoV 的基因組是一段連續(xù)的單鏈正股 RNA，是一個多順反子，大小在 27~32Kb 之間，是目前所有 RNA 病毒中基因組最大的（Lai et al., 1997）。CCoV 基因組 RNA 的 5’端和 3’端分別為典型的帽子結(jié)構(gòu)（cap）和多聚 A 尾，從 5' 端到 3' 端包含 10 個開放性閱讀框架（ORF）（Horsburghet al., 2012; Jose et al., 2012）。5'端為兩個重疊的開放閱讀框 ORF1a（12354 bp）和 ORF1b（8037bp），編碼與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的 RNA 依賴的 RNA 聚合酶和蛋白酶，其余 8 個 ORF 占整個基因組序列的 1/3，從 5' ~3' 端依次為 S（4362 bp），ORF3a（213 bp），ORF3b（735 bp），ORF3c（238 bp），E（246 bp），M（798 bp），N（1203 bp），ORF7a（303bp），ORF7b（639 bp）（圖 1.2）（關(guān)振宏，2004; Decaro N et al., 2015）。其中 ORF3a、ORF3b 和 ORF3c 中存在交叉重疊，ORF1b 與 S 相鄰，其余各 ORF 間由內(nèi)含子分隔開。圖 1.1 CCoV 的結(jié)構(gòu)模式圖（王欣宇, 2017）Fig. 1.1 The model diagram of CCoV (Wang Xinyu, 2017)
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2665478