【摘要】：酮病是高產(chǎn)奶牛泌乳早期高發(fā)性營(yíng)養(yǎng)代謝病之一,對(duì)奶牛健康有較大影響。為認(rèn)識(shí)奶牛酮病的發(fā)生機(jī)制,本研究通過(guò)腸道微生物組學(xué)手段研究酮病奶牛與健康奶牛的腸道微生物區(qū)系的差異性,探討奶牛酮病發(fā)生的原因,并對(duì)泌乳早期奶牛灌服葡萄籽提取物原花青素(GSPE),了解它對(duì)奶牛酮病相關(guān)指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)等的影響,具體研究?jī)?nèi)容如下:1.健康奶牛與酮病奶牛腸道微生物區(qū)系的差異性分析根據(jù)配對(duì)設(shè)計(jì)的原則從某奶牛場(chǎng)產(chǎn)后泌乳早期的奶牛中篩選出酮病組(KET)及其對(duì)照組(CON)奶牛各22頭,其中KET組由臨床酮病組(CK組,n = 3)和亞臨床酮病組(SK組,n= 19)組成。在檢出酮病當(dāng)天采集KET組及其CON組奶牛的后腸道糞便,再提取其所有微生物的基因組DNA,通過(guò)Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)利用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示:(1)操作分類單位(OTUs)分析與物種注釋:獲得75724個(gè)OTUs,有效數(shù)據(jù)3739252Tags。GraPhlAn圖顯示,CK組優(yōu)勢(shì)菌群:厚壁菌、放線菌、擬桿菌、變形菌,以及少量的廣古菌;SK組優(yōu)勢(shì)菌群:厚壁菌、變形菌,但廣古菌不在其列;CON組優(yōu)勢(shì)菌群:厚壁菌、放線菌、擬桿菌,以及少量的螺旋菌和廣古菌。柱形累加圖顯示,三組在門(mén)水平上豐度前十的物種相似,其中厚壁菌與擬桿菌總和均超過(guò)80%,在屬水平上豐度前十的物種則差異較大,鏈球菌和lachnoclostridium只在CK組前十,布赫納氏菌只在SK組前十。(2)組間OTUs共享性分析:三組樣品OTUs的韋恩圖顯示,CK組與CON組共享1967個(gè)OTUs,CON組獨(dú)有696個(gè)OTUs,CK組獨(dú)有35個(gè)OTUs;SK組與CON組共享2544個(gè)OTUs,SK組獨(dú)有191個(gè)OTUs,CON組獨(dú)有119個(gè)OTUs。CK組與SK組共享1967個(gè)OTUs,CK獨(dú)有35個(gè)OTUs,SK組獨(dú)有768個(gè)OTUs。(3)組間比較分析:主坐標(biāo)分析顯示,Unweighted算法得出KET組與CON組奶牛腸道微生物群落差異較大,Weighted算法得出三組樣品群落組成結(jié)構(gòu)相似。主成分分析(PCA)顯示,三組樣品群落組成相似。無(wú)度量多維標(biāo)定法(NMDS)顯示,KET組與CON組奶牛腸道微生物有差異。Anosim檢驗(yàn)顯示,組間差異顯著且大于組內(nèi)差異,CK與CON和SK與CON間差異均顯著,CK組與SK組則不顯著。置換多因素方差(ADONIS)分析顯示,KET組和SK組均與CON組差異顯著,而CK組與CON組、CK組和SK組則均不顯著,酮病對(duì)奶牛腸道微生物有顯著影響。T-test檢驗(yàn)顯示,在門(mén)水平上的差異物種,CK組與CON組是酵母菌,SK組與CON組、KET組和CON組都是廣古菌,而CK組與SK組則無(wú)。在屬水平上的差異物種,CK組與CON組是Candidatus_Saccharimonas,Erysipelotrichaceae_UGG-008;SK 組與 CON組是鏈球菌屬(SK組含量極少)、甲烷短桿菌、普雷沃氏菌、Erysipelotrichaceae_UGG-009、毛螺旋菌、Parabacteroides和奇異菌,KET組和CON組是瘤胃球菌屬、甲烷短桿菌屬、Erysipelotrichaceae_UGG-009、毛螺旋菌屬和奇異菌屬,CK組與SK組則無(wú);在種水平上的差異物種,SK組與CON組是丁酸梭菌,SK組與CON組、SK組與CK組、KET組與CON組均無(wú)。LefSe分析顯示,SK組的核心菌群是變形菌、布赫納氏菌和腸桿菌;CK組核心菌群是γ-變形菌和腸桿菌;CK組的活潑瘤胃球菌含量高于SK組的。SK組的梭狀芽胞桿菌和Christensenellaceae則比CK組的高,但差異不顯著。2.飼喂GSPE對(duì)奶牛血漿和乳汁酮病相關(guān)指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)等的影響將符合入選條件的48頭泌乳早期荷斯坦奶牛按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)原則分成四組:對(duì)照組(GO)和三個(gè)試驗(yàn)組(G20、G40和G80),每組12頭奶牛。給各組奶牛分別灌服0、20、40和80mg GSPE/kg BW/day,于第0(灌服前)、10、20、30、40和50d統(tǒng)計(jì)產(chǎn)奶量(MY),第0(灌服前)、7、14、21、28、35和42d采集奶樣和血樣,檢測(cè)分析以下酮病相關(guān)等指標(biāo):酮體(KB)、游離脂肪酸(NEFA)、血糖(GLU)、總抗氧化能力(TAC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)、過(guò)氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)、ALT、AST、GGT、TP、ALB、GLOB、BUN、UA、膽固醇、乳蛋白(MP)、非脂乳固體(SNF)、乳脂(MF)、體細(xì)胞計(jì)數(shù)(SCC)。結(jié)果顯示,三個(gè)試驗(yàn)組血漿KB、NEFA和GLU水平與CON組沒(méi)有顯著差異,但KB在時(shí)間上存在極顯著差異,KB與泌乳天數(shù)(DIM)交互有極顯著差異(P = 0.0003)。GSH-Px、SOD、TAC和MDA均與試驗(yàn)時(shí)間極顯著相關(guān)(P0.0001),G20的MDA含量在14d時(shí)與G0相比顯著增加(P=0.0371)。實(shí)驗(yàn)組的 ALT、AST、ALB、GLOB 和 TP 和 BUN 和 UA,以及GPX、SOD、TAC和H2O2水平與對(duì)照組的水平之間未見(jiàn)顯著差異。3.飼喂GSPE對(duì)奶牛的安全性研究將符合入選條件的16頭泌乳早期荷斯坦奶牛按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)原則分成四組:對(duì)照組(g0組)和三個(gè)試驗(yàn)組(g20、g40和g80),各組奶牛分別灌服 0、20、40和 80 毫克 GSPE 每千克體重(BW)每天(mg GSPE/kg BW/day),每24h灌服1次,持續(xù)168h。于第0(灌服前)、3、6、12、24、48、72、96、120、144和168h采血檢測(cè)和分析以下指標(biāo):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、球蛋白(GLOB)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)。結(jié)果顯示,g20 組在 120h 時(shí),其 ALB(P=0.0361)和 BUN(P=0.0478)顯著高于對(duì)照組,而g40、g80組的BUN均與對(duì)照組無(wú)顯著差異。g20、g40和g80組與對(duì)照組在ALT、AST、GGT、GLOB、TP和UA上均無(wú)顯著差異。結(jié)論:(1)酮病對(duì)后腸道微生物區(qū)系影響顯著,CK與CON的差異物種在門(mén)水平上是廣古菌門(mén),在屬水平上是瘤胃球菌屬、甲烷短桿菌屬、Erysipelotrichaceae_UGG-009屬、毛螺旋菌屬和奇異菌屬;(2)與CON奶牛相比,SK奶牛后腸道廣古菌門(mén)細(xì)菌顯著減少,甲烷短桿菌屬尤為明顯。后腸道的鏈球菌屬、甲烷短桿菌屬、普雷沃氏菌屬、Erysipelotrichaceae_UGG-009屬、Parabacteroides屬和奇異菌屬的顯著減少,毛螺旋菌屬和丁酸梭菌種的顯著升高是奶牛亞臨床酮病的特征;(3)飼喂GSPE對(duì)泌乳早期奶牛血漿KB、NEFA和GLU水平與CON組沒(méi)有顯著差異,但KB在時(shí)間上存在極顯著差異,KB與泌乳天數(shù)交互有極顯著差異,(P = 0.0003);(4)給奶牛飼喂GSPE在氧化抗氧化方面,GSH-Px、SOD、TAC和MDA均與試驗(yàn)時(shí)間極顯著相關(guān)(P0.0001),MDA而在處理組與試驗(yàn)時(shí)間交互上存在存在顯著差異(P = 0.0463)。因暫無(wú)法肯定GSPE對(duì)酮病治療有明顯的積極作用,有待今后作更深入研究再?zèng)Q定是否推薦使用該產(chǎn)品。
【圖文】：

產(chǎn)奶量（ＭＹ）在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與初始產(chǎn)奶量（ＭＹ－０）極顯著相關(guān)（估計(jì)值＝０．０２５４，邋Ｐ＜逡逑０．０００１），同時(shí)還與試驗(yàn)時(shí)間極顯著相關(guān)（Ｐ＜邋０．０００１）。而在處理組與試驗(yàn)時(shí)間交互上逡逑存在極顯著的影響（Ｐ邋＝邋０．００２５），，其標(biāo)準(zhǔn)最小二乘圖如圖３－２所示。逡逑３．６逡逑：。逡逑２邋３．２邐Ｇ４０逡逑３．．邐一８。逡逑０邐１０邐２０邐３０邐４０邐５０逡逑Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｔｉｍｅ，邋ｄ逡逑圖３－２試驗(yàn)期間產(chǎn)奶量（ＭＹ）的最�。撼似骄鶖�(shù)變化情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｌｅａｓｔ邋ｓｑｕａｒｅ邋ｍｅａｎｓ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｍｉｌｋ邋ｙｉｅｌｄ邋ｄｕｒｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｐｅｒｉｏｄ逡逑ＧＯ、Ｇ２０、Ｇ４０和Ｇ８０分別表示飼喂０、２０、４０和８０ｍｇＧＳＰＥ／ｋｇｏｆｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ的組。逡逑５逡逑

Ｐ邋＝邋０．０３３６）顯著相關(guān)。同時(shí)還與試驗(yàn)時(shí)間極顯著相關(guān)（Ｐ＜邋０．０００９），與處理組顯著相逡逑關(guān)（Ｐ＝０．００２１）。而在處理組與試驗(yàn)時(shí)間交互上存在極顯著的影響（尸＝０．００２３），其逡逑標(biāo)準(zhǔn)最小二乘圖如圖３－３所不。逡逑１．３８逡逑．１２８邋１逡逑ｆＬ１８邋Ｔ邋一。逡逑０．９８邐ｆ逡逑０．８８逡逑０邐７邐１４邐２１邐２８邐３５邐４２逡逑Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｔｉｍｅ，邋ｄ逡逑圖３－３試驗(yàn)期間乳蛋白（ＭＰ）的最小二乘平均數(shù)變化情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－３邋Ｌｅａｓｔ邋ｓｑｕａｒｅ邋ｍｅａｎｓ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｍｉｌｋ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｄｕｒｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｐｅｒｉｏｄ逡逑ＧＯ、Ｇ２０、Ｇ４０和Ｇ８０分R%表示飼喂０、２０、４０和８０ｍｇＧＳＰＥ／ｋｇｏｆｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ的組。逡逑ｓ逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.23

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本文編號(hào)：2664311