【摘要】：19世紀(jì)以來的家畜良種化進(jìn)程使全球性的家畜品種逐漸趨于單一化,大量的遺傳資源尤其是地方品種遭到破壞。直至21世紀(jì)初,全球已知的7616個(gè)家畜品種中已有45%的品種瀕臨滅絕。在哺乳動(dòng)物家畜中,體細(xì)胞核移植、體外受精和胚胎移植技術(shù)均已成功,能夠結(jié)合精子、卵子、胚胎甚至是體細(xì)胞的凍存,實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的保護(hù)和物種復(fù)原。由于卵生的特點(diǎn),上述方法均難以在家禽上實(shí)現(xiàn)。家禽的原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell,PGC)具有獨(dú)特的通過血液遷移定居于性腺的特點(diǎn),使得PGC遷移路徑成為實(shí)現(xiàn)禽類物種復(fù)原的唯一途徑。但是單個(gè)胚胎所獲取的PGC遠(yuǎn)不足以滿足實(shí)際應(yīng)用所需。尤其是瀕危品種的PGC來源成為了限制這一技術(shù)的難題。而體細(xì)胞能夠在短期內(nèi)大量獲取,若能將其誘導(dǎo)成PGC無疑是解決這一困難的最佳路徑。為了解決雞體細(xì)胞誘導(dǎo)為PGC的難題,本研究對(duì)狼山雞的雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken embryonic fibroblast,CEF)通過單細(xì)胞克隆技術(shù)進(jìn)行了建系,獲得了狼山雞胚成纖維細(xì)胞單克隆細(xì)胞系(Chicken embryonic fibroblast single cloned cell line-Langshan,CSC-LS)。在 CEF和CSC-LS中通過慢病毒過表達(dá)重編程因子Oct4,Sox2,Nanog和Lin28結(jié)合BMP4/BMP8b/EGF誘導(dǎo)體系,將CEF重編程誘導(dǎo)出具有遷移能力的iPGC。以黑羽狼山雞為供體,隱性白羽雞為受體,建立了由CEF誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠遷移PGC的方法。同時(shí),通過制備黑羽狼山雞與隱性白羽雞的原代PGC遷移模型產(chǎn)生供體PGC的后代,驗(yàn)證了 PGC路徑的可行性,為iPGC的應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:(1)CSC-LS CEF單克隆細(xì)胞的建立對(duì)狼山雞CEF進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)使之出現(xiàn)凋亡并進(jìn)入增殖危機(jī),繼續(xù)培養(yǎng)獲得極少數(shù)永生化細(xì)胞株。永生化細(xì)胞株經(jīng)過單細(xì)胞挑取傳代培養(yǎng)能夠建立CSC-LS單克隆細(xì)胞系。對(duì)單細(xì)胞克隆的培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn),Ham's F12是制備單細(xì)胞克隆的最適培養(yǎng)基,克隆效率為25%±0.01,顯著高于DMEM(11%±0.01)和D/F12(12%±0)培養(yǎng)基,口吸管法的單克隆制備效率為32.29%±0.04顯著高于有限稀釋法的6.95%±0.01。CSC-LS細(xì)胞系與正常的CEF相比具有正常的二倍體核型但增殖能力極顯著增強(qiáng)(PM.01),增長(zhǎng)曲線呈倒S型,細(xì)胞周期G2/M期所占比例29.3±0.01極顯著高于原代CEF的19.12%±0.01;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CSC-LS無軟瓊脂克隆能力,原癌基因Ras,c-myc,Src 在 CSC-LS 中的表達(dá)量分別為 0.95±1.01,2.70±0.21 和 1.27±0.06 顯著低于 DF-1的 0.97±0.99,4.95±0.50 和 11.84±1.27(P0.05),極顯著低于 DT40 細(xì)胞的 13.49±2.7,19.21±1.23,16.58±1.53(P0.01);CSC-LS提高了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染效率為51.3%±0.01極顯著高于原代CEF的1.3%±0.003(P0.01)。(2)CEF向iPGC重編程誘導(dǎo)體系的建立成功構(gòu)建Oct4,Sox2,Nanog,Lin28慢病毒過表達(dá)載體。優(yōu)化慢病毒對(duì)CEF和CSC-LS的感染條件,確定5μg/ml聚凝胺,MOI10為最佳感染條件。CEF重編程過程中細(xì)胞形態(tài)在慢病毒過表達(dá)重編程因子后,在第5天時(shí)由成纖維的梭狀逐漸變圓聚集,形成克隆,第15天時(shí)iPS細(xì)胞形態(tài)逐漸明顯,17天后開始形成清晰的克隆集落,能夠通過單克隆挑取進(jìn)行傳代培養(yǎng)重新形成細(xì)胞克隆,OSNL介導(dǎo)的iPS誘導(dǎo)效率為0.59%±0.03,在此基礎(chǔ)上添加VPA后的iPS誘導(dǎo)效率為1.36%±0.24,VPA+VC為1.66%±0.01,均極顯著高于僅過表達(dá)OSNL的組別(P0.01),初步確定OSNL+VPA+VC為最佳iPS誘導(dǎo)體系并進(jìn)行后續(xù)鑒定。獲得的iPSC能夠被SSEA-1所標(biāo)記,堿性磷酸酶所染色,具有二倍體染色體核型。較CEF相比,能夠高表達(dá)多能性基因Nanog,Oct,Sox2,SSEA-1,CLCD3,Klf4,Rps17,SALL4 差異極顯著(P0.01)。Edu 染色發(fā)現(xiàn)iPSC有53.30%±0.23的細(xì)胞處于增殖狀態(tài)較飼養(yǎng)層CEF的6.40%±0.05有極顯著差異(P0.01)。從感染后第3天至誘導(dǎo)21天對(duì)CEF和CSC-LS的內(nèi)源性多能基因的表達(dá)變化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CEF在重編程過程中能夠激活內(nèi)源多能性基因Oct4,Sox2,Nanog,Lin28和SSEA-1的表達(dá);Oct4,Sox2,Nanog均在第21天的表達(dá)量達(dá)到最高分別為12.95±1.7,132.1±7.7,22.21±2.3。Lin28 在第 15 天時(shí)表達(dá)量最高為 25.11±3.08,CSC-LS 不能啟動(dòng) Sox2,SSEA-1和Oct4的表達(dá)。對(duì)Oct4,Sox2,Nanog,Lin28的啟動(dòng)子DNA甲基化水平分析發(fā)現(xiàn)Oct4,Sox2,Nanog的DNA甲基化水平在誘導(dǎo)過程中持續(xù)下降,但Lin28的則無明顯變化規(guī)律。基于前期建立的ESC向PGC誘導(dǎo)模型進(jìn)行體外優(yōu)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:與BMP4誘導(dǎo)過程相比,BMP8b和EGF能夠提高ESC向PGC的誘導(dǎo)效率至26.2%±0.01與BMP4組的7.3%±0.01相比差異極顯著(P0.01)。通過相同的體系將iPSC向iPGC誘導(dǎo),形態(tài)學(xué)上細(xì)胞在誘導(dǎo)2天時(shí)開始聚集形成類胚體,4天后開始逐漸聚集增大。iPGC與第二天開始形成誘導(dǎo)效率在第四天達(dá)到最高為12.2%±0.01;獲得的iPGC能表達(dá)Cvh蛋白;通過希夫試劑能夠染色標(biāo)記iPGC中的糖原顆粒;iPGC能夠表達(dá)PGC的標(biāo)記基因Cvh,C-kit,Blimp1和部分iPSC的多能性基因Nanog,Sox2,Oct4。將獲得的iPGC在2.5天通過雞胚血管注射至雞胚,實(shí)時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)iPGC其能夠通過血液遷移至生殖脊,通過冰凍切片能夠觀察到其綠色熒光,并能夠通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)出GFP的表達(dá)。整個(gè)誘導(dǎo)過程中表觀遺傳修飾參與調(diào)控:組蛋白H3K4me2在CEF向iPGC誘導(dǎo)過程中呈先上升后下降趨勢(shì),在iPSC向iPGC誘導(dǎo)第四天時(shí)表達(dá)量最高后逐漸下降,組蛋白乙�；皆贑EF向iPSC誘導(dǎo)過程呈上升趨勢(shì),iPSC向iPGC誘導(dǎo)過程中在第2天下降后上升。(3)PGC遷移模型的建立將從生殖嵴分離得到的PGC進(jìn)行無飼養(yǎng)層培養(yǎng)純化并收集含有大量細(xì)胞克隆的PGC;純化后的PGC中的糖原顆粒能夠被希夫試劑染色;表達(dá)Cvh和C-kit蛋白;并且高表達(dá)的PGC標(biāo)記基因c-kit,Blimp1,Dazl和Cvh,表達(dá)量分別為17.91±0.43,56.26±3.60,14.73±0.23,82.22±2.63 較 CEF 差異極顯著(P0.01)。為了驗(yàn)證 PGC與iPGC的遷移能力,通過雞胚血管注射實(shí)驗(yàn)分析四種細(xì)胞CEF,ESC,PGC,iPGC的性腺定向遷移能力發(fā)現(xiàn),僅有PGC和iPGC能夠通過血管注射遷移至生殖脊。通過2.5天的血管注射試驗(yàn)?zāi)軌颢@得含有供體PGC的雞胚,在18.5天的雞胚性腺中能夠通過冰凍切片檢測(cè)供體PGC的存在。通過將狼山雞和隱性白羽的PGC分別注射進(jìn)對(duì)方的雞胚中均能夠形成產(chǎn)生植入PGC的后代,四實(shí)驗(yàn)組分別為正常白母雞×實(shí)驗(yàn)黑公雞,實(shí)驗(yàn)黑母雞×正常白公雞,實(shí)驗(yàn)白母雞×正常白公雞,正常白母雞×實(shí)驗(yàn)白公雞,通過微衛(wèi)星座位LEI094檢測(cè)出F2代雞為狼山雞后代LEI094長(zhǎng)度為290,294,隱性白羽雞LEI094長(zhǎng)度為311,統(tǒng)計(jì)各后代產(chǎn)生效率分為12.04%,10.11%,8.96%,8.70%,平均效率為9.95%。
【圖文】：

目的與意義逡逑濟(jì)的不斷發(fā)展，良種專門化品系的家畜已逐漸不能夠滿足市場(chǎng)的度來看，少數(shù)高產(chǎn)品種所存在的遺傳內(nèi)容是貧乏的。目前人類社會(huì)竭的現(xiàn)實(shí)，對(duì)動(dòng)物遺傳資源保護(hù)到了前所未有的關(guān)鍵時(shí)刻。對(duì)于哺胞核移植克隆技術(shù)、體外受精、胚胎移植技術(shù)的日益成熟，只要對(duì)行保存就可以通過這些技術(shù)實(shí)現(xiàn)物種復(fù)原。但由于家禽卵生的特點(diǎn)。家禽的ＰＧＣ在發(fā)育的過程中具有從血液遷移至性腺的特點(diǎn)，使得使ＰＧＣ遷移至性腺發(fā)育。這也是在家禽上實(shí)現(xiàn)物種復(fù)原的唯一途殖嵴一次分離ＰＧＣ的數(shù)量為２－５ｘｌ0３，而一次注射至少需要３ｘｌ0３種的ＰＧＣ來源遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際需求，成為了限制這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)的上進(jìn)行基因編輯以及轉(zhuǎn)基因仍存在著一定的技術(shù)困難。而體細(xì)胞能且易于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因及基因編輯操作，若能將其誘導(dǎo)成ＰＧＣ無疑是

２．１邋ＣＥＦ單克隆細(xì)胞系ＣＳＣ－ＬＳ的建立逡逑２．１．１細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察逡逑原代的ＣＥＦ在通過胰蛋白酶法進(jìn)行分離培養(yǎng)，原代雞成纖維細(xì)胞呈紡錘狀或星型的扁逡逑平狀結(jié)構(gòu)，輪廓清晰（圖２－２）。逡逑原代ＣＥＦ細(xì)胞能夠進(jìn)行傳代培養(yǎng)并且能夠穩(wěn)定增殖１０代左右，但經(jīng)過一定時(shí)間的傳逡逑代培養(yǎng)后，細(xì)胞的增殖能力會(huì)下降且開始出現(xiàn)凋亡的現(xiàn)象。在人和小鼠的原代細(xì)胞培養(yǎng)過逡逑程中，在傳至１０代左右時(shí)細(xì)胞通常生長(zhǎng)出現(xiàn)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，但有極少數(shù)的細(xì)逡逑胞能夠度過危機(jī)繼續(xù)增殖或者傳代。本研究發(fā)現(xiàn)ＣＥＦ在連續(xù)培養(yǎng)的過程中，極少數(shù)細(xì)胞能逡逑夠度過危機(jī)并且繼續(xù)增殖，，最終度過危機(jī)形成新的細(xì)胞系（圖２－３）。逡逑自發(fā)永生化產(chǎn)生的細(xì)胞系具有較多的雜細(xì)胞，通過自制的口吸管可以將單細(xì)胞種植在逡逑％孔板中，經(jīng)過一周的培養(yǎng)可形成可供傳代的單克隆集落（圖２－４）。通過傳代培養(yǎng)可將單克逡逑隆由９６孔板依次傳代至４８孔，２４孔，１２孔，６孔直至在６０ｍｍ邋口徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培逡逑養(yǎng)，逐漸形成能夠持續(xù)傳代培養(yǎng)的單克隆細(xì)胞系ＣＳＣ－ＬＳ（圖２－５）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S831

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6 令文慧;應(yīng)用“間接譜系轉(zhuǎn)化”技術(shù)重編程小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成為誘導(dǎo)性少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的研究[D];西南大學(xué);2019年

7 張小敏;細(xì)胞重編程調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的非線性隨機(jī)動(dòng)力學(xué)研究[D];華中師范大學(xué);2018年

8 姜霖;NG納米—蛋白復(fù)合體的構(gòu)建及其重編程誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心臟祖細(xì)胞分化的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

9 賀海鵬;共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白的抑制促進(jìn)體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

10 丁香香;豬組蛋白及其變體表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)豬體細(xì)胞重編程的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2664188