【摘要】：豬藍(lán)耳病即豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為特征的一種急性高度接觸性傳染病,具有較高的發(fā)病率和死亡率。近年來(lái),貴州省部分地區(qū)規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)陸續(xù)發(fā)生了疑似PRRS疫情,為更好地預(yù)防和控制豬藍(lán)耳病的發(fā)生,本研究開(kāi)展了以下工作:1.貴州省豬藍(lán)耳病免疫狀況調(diào)查:為弄清貴州養(yǎng)豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病免疫狀況,本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法對(duì)2015年至2017年采集的豬血清樣本計(jì)88146頭份進(jìn)行豬藍(lán)耳病抗體檢測(cè),結(jié)果:2015年~2017年貴州省9個(gè)地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)(戶(hù))豬藍(lán)耳病免疫覆蓋率平均水平為68.9%,其中種豬場(chǎng)、商品場(chǎng)和散養(yǎng)戶(hù)分別為100%、82.8%和47.1%;免疫抗體合格率平均為82.2%,其中種豬場(chǎng)、商品場(chǎng)和散養(yǎng)戶(hù)分別為98.9%、81.9%和59.2%;春、夏、秋和冬季豬藍(lán)耳病免疫合格率分別為81.6%、83.0%、81.9%和82.2%;海拔800m以下、海拔800m~1600m和海拔1600m以上養(yǎng)豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病免疫合格率分別為81.1%、82.8%和81.1%。這表明貴州省豬藍(lán)耳病免疫效果較好,但不同類(lèi)型養(yǎng)豬場(chǎng)(戶(hù))存在較大差異,而不同季節(jié)和海拔高度對(duì)豬藍(lán)耳病免疫效果無(wú)明顯影響。2.貴州省豬藍(lán)耳病感染情況調(diào)查:為弄清貴州省養(yǎng)豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病感染情況,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)臨床疑似病例的臨床癥狀與病理剖解觀察以及采對(duì)2015年至2017年采集的豬組織樣本計(jì)9751頭份進(jìn)行豬藍(lán)耳病病原RT-PCR檢測(cè),結(jié)果:感染豬具明顯的PRRS臨床癥狀和病理變化,即體溫升高以及典型的呼吸道與繁殖障礙癥狀;肺臟肉樣病變、脾邊緣丘狀梗死、雀斑腎和淋巴結(jié)呈大理石樣變等;豬場(chǎng)(戶(hù))疑似病例豬藍(lán)耳病病原核酸檢出率平均為26.5%,其中種豬場(chǎng)、商品場(chǎng)和散養(yǎng)戶(hù)分別為13.0%、26.5%和31.0%;PRRSV經(jīng)典毒株與變異毒株檢出率分別為11.3%和15.2%;春、夏、秋和冬4個(gè)季PRRSV核酸檢出率分別為17.9%、29.3%、28.2%和26.6%;在PRRSV感染病例中,存在多種病毒二重或多重感染,其中以豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒和豬偽狂犬病病毒為主,混合感染率分別為28.4%、25.5%和13.9%。這說(shuō)明,貴州省養(yǎng)豬場(chǎng)(戶(hù))普遍存在PRRSV感染。3.豬藍(lán)耳病病毒貴州株分離鑒定與基因變異分析:為了解豬藍(lán)耳病病毒貴州流行株變異情況,本實(shí)驗(yàn)采集疑似PRRS病料組織樣本進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)、病毒抗原與核酸鑒定以及GP5基因和NSP2基因克隆測(cè)序分析,結(jié)果:病料接種后Marc-145細(xì)胞可見(jiàn)明顯CPE現(xiàn)象,如細(xì)胞皺縮、聚集成堆和灶狀脫落等;經(jīng)間接熒光抗體染色,在病料感染細(xì)胞中可見(jiàn)到明顯黃綠色熒光;RT-PCR擴(kuò)增可見(jiàn)與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致的PRRSV N基因特異性片段(254bp)和GP5基因特異性片段(603bp);經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)GP5基因序列與新近流行PRRSV毒株如JXA1株、HUN4株、CG株和LC0810株的相似度高達(dá)97.8%~99.9%,而與早期PRRSV經(jīng)典毒株如HB-2株、Ch-1a株和VR-2332株的相似度只有88.6%~94.5%,GP5基因編碼蛋白存在一定的氨基酸點(diǎn)突變;對(duì)擴(kuò)增得到大小為1064bp的NSP2基因片段進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該基因片段與新近流行PRRSV毒株如JXA1株、HUN4株、CG株和LC0810株的相似度為90.1%~99.5%,而與早期PRRSV經(jīng)典毒株如HB-2株、Ch-1a株和VR-2332株的相似度只有78.1%~88.7%,NSP2基因編碼蛋白存在31個(gè)aa和59個(gè)aa的缺失。這說(shuō)明,本實(shí)驗(yàn)成功分離得到了高致病性PRRSV貴州流行株。4.貴州省豬藍(lán)耳病病毒生物媒介調(diào)查:為了解貴州省部分規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)PRRSV生物媒介情況,本研究采集臨床發(fā)病豬場(chǎng)和臨床健康豬場(chǎng)的蚊、蠅和鼠樣本,經(jīng)種類(lèi)鑒定后提取病毒RNA,以PRRSV N基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,取陽(yáng)性樣本進(jìn)行Nsp2基因的擴(kuò)增與克隆測(cè)序,結(jié)果顯示:貴州規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)的生物媒介主要是三帶喙庫(kù)蚊(1985只,占蚊總數(shù)50.1%)、白紋伊蚊(1028只,占蚊總數(shù)25.9%)、致倦庫(kù)蚊(559只,占蚊總數(shù)14.1%)、家蠅(1266只,占蠅總數(shù)77.2%)和褐家鼠(68只,占鼠總數(shù)100%);在8個(gè)PRRS臨床發(fā)病豬場(chǎng)相應(yīng)有5、5、4、2和1個(gè)豬場(chǎng)的三帶喙庫(kù)蚊、白紋伊蚊、致倦庫(kù)蚊、家蠅和褐家鼠樣本檢出PRRSV N基因片段,豬場(chǎng)檢出率相應(yīng)為62.5%、62.5%、50.0%、25.0%和12.5%,而臨床健康豬場(chǎng)蚊、蠅和鼠樣本中均未檢出;從三帶喙庫(kù)蚊、白紋伊蚊、致倦庫(kù)蚊、家蠅和褐家鼠樣本中擴(kuò)增得到的PRRSV Nsp2基因片段序列與從該豬場(chǎng)發(fā)病豬病毒完全一致。這提示蚊/蠅/鼠等可攜帶PRRSV,在PRRS發(fā)生與流行上可能發(fā)揮重要作用。5.豬藍(lán)耳病病毒在白紋伊蚊體內(nèi)增殖的可能性研究:為驗(yàn)證白紋伊蚊是否為PRRSV生物性傳播媒介,本研究選取PRRSV GY株細(xì)胞培養(yǎng)物與等量新鮮豬血混合并吸染白紋伊蚊,采集不同時(shí)間段和不同世代蚊蟲(chóng)樣本,提取病毒RNA,采用PRRSV N基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),同時(shí)固定、超薄切片和電子顯微鏡觀察,結(jié)果:吸染PRRSV后0h、6h、12h、18h和24h成蚊樣本可檢測(cè)出PRRSV N基因特異性片段,而吸染PRRSV后30h、36h、42h、48h、5d和7d成蚊樣本均未能檢測(cè)出該片段;吸染PRRSV成蚊的蚊卵在孵育1d、2d、4d、7d幼蟲(chóng)和蛹蟲(chóng)及1d、3d成蚊,均未檢測(cè)出PRRSV N基因特異性片段;在吸染PRRSV后12h、24h、48h和5d的成蚊樣本中均未能觀察到PRRSV病毒粒子。這表明,PRRSV不在白紋伊蚊體內(nèi)進(jìn)行增殖和世代傳遞,白紋伊蚊只是PRRSV的一種機(jī)械性攜帶媒介。
【圖文】：

根據(jù)病毒抗原性的差異，，PRRSV 可分為兩種基因型：一種為歐洲型即 Genotype-1其代表毒株為 LV 株；另一種為北美洲型即 Genotype-2，其代表毒株為 VR-2332 株圖 1 PRRSV 粒子示意圖Fig.1 Map of PRRSV particle. (Music and Gagnon. 2010)

RSV 基因組編碼的蛋白及其功能圖 2 PRRSV 基因組復(fù)制示意圖Fig.2 Replication map of the PRRSV genome.(Ying Fang, 2010)
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：2665364