發(fā)布時(shí)間：2020-05-13 22:04

【摘要】：小反芻動(dòng)物慢病毒(SRLV)是山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)和梅迪-維斯納病毒(MVV)的統(tǒng)稱(chēng),主要引起山羊和綿羊的慢性持續(xù)性感染,表現(xiàn)為山羊的關(guān)節(jié)炎、腦脊髓炎和綿羊的間質(zhì)性肺炎等。這兩種病毒感染具有一定的宿主特異性,即CAEV多感染山羊,而MVV傾向于感染綿羊。但近年來(lái)的分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),其可跨種感染,并且基于病毒pol-gag基因序列可分為A、B、C、D和E五個(gè)亞群,當(dāng)前建立的病原分子生物學(xué)檢測(cè)方法僅適用于部分基因亞群毒株的檢測(cè),因而建立通用的CAEV和MVV核酸檢測(cè)方法極為必要。本研究對(duì)GenBank公布的31株SRLV前病毒基因組序列進(jìn)行比對(duì),篩選出vif基因上約150bp的序列作為診斷標(biāo)記物并設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,通過(guò)全基因合成方法獲得該序列作為PCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照模板,以此建立了SRLV通用PCR檢測(cè)方法;在此基礎(chǔ)上,使用SYBR Green I染料建立實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。為驗(yàn)證建立的病原分子生物學(xué)檢測(cè)方法,進(jìn)行CAEV人工感染動(dòng)物試驗(yàn),并于感染前70天、10天;感染后第4天、8天、15天、23天、28天、42天、58天、71天、84天、99天、113天采集5mL的抗凝血。每次采血后,在72小時(shí)內(nèi),取1mL全血提取總DNA進(jìn)行CAEV前病毒DNA的檢測(cè);隨后,將抗凝血離心后取200μL的血漿用于提取病毒的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法來(lái)檢測(cè)病原及其載量,并使用IDEXX SRLV抗體篩查試劑盒檢測(cè)血清抗體。此外,采集了2017-2018年間新疆烏魯木齊縣、阿克蘇、烏蘇、巴楚縣、富蘊(yùn)縣等地區(qū)的165只山羊樣本進(jìn)行抗體檢測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)。研究結(jié)果表明篩選的位于SRLV vif基因上的150bp序列可作為其通用診斷標(biāo)識(shí)物,建立的通用PCR檢測(cè)方法,其敏感性為10~3個(gè)分子拷貝數(shù),并初步證實(shí)其可用于CAEV和MVV野毒株RNA和前病毒DNA的檢測(cè);使用SYBR Green I染料建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法其敏感性不低于100個(gè)分子拷貝數(shù),線性范圍為10~2-10~7分子拷貝數(shù),且可用于CAEV動(dòng)物感染的檢測(cè),較感染抗體被檢出的時(shí)間提前。此外,在烏蘇縣和巴楚縣分別檢出25%和20%的CAEV血清學(xué)陽(yáng)性樣本,新疆地區(qū)CAEV血清學(xué)陽(yáng)性率為2.4%,再次證實(shí)新疆有該病的流行。該研究建立的方法有望用于我國(guó)SRLV的病原學(xué)檢測(cè),并提示新疆地區(qū)有必要開(kāi)展大范圍的CAEV流行病學(xué)調(diào)查以掌握其流行情況、制訂防控方案。
【圖文】：

圖 1 我國(guó)小反芻動(dòng)物慢病毒的分布情況Fig.1 Distribution of small ruminant lentiviruses in China除新疆、四川是 CAEV 和 MVV 共同分布的地區(qū)，其余為 CAEV 分布的地區(qū)。理化、分子生物學(xué)特征理化特征炎-腦炎病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、慢病毒亞科，是有囊膜的單股，直徑大小為 70-100nm。CAEV 對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較差，經(jīng)力。該病毒具備特殊的囊膜結(jié)構(gòu)，對(duì)有機(jī)溶劑比較敏感。其相06Da，在氯化銫中的浮密度為 1.14-1.6g/mL。病毒主要由反轉(zhuǎn)膜糖蛋白組成。其中，核心蛋白主要是 p28，另外還有 p19、p則是以 gp135 為主。CAEV 主要感染單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并或睪丸等細(xì)胞上增殖[42]，山羊關(guān)節(jié)滑膜（Goat synovial membrEV 的分離和體外培養(yǎng)，是該病毒的指示細(xì)胞。將感染病羊的周血單核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）與夠分離得到 CAEV 毒株，并獲得良好的病毒增長(zhǎng)和繁殖。在

的細(xì)胞內(nèi)增殖，，出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect, CPE)。MVV 的指示細(xì)脈絡(luò)叢細(xì)胞（SCP）。細(xì)胞病變效應(yīng)向外擴(kuò)展直至完全覆蓋單層細(xì)胞培養(yǎng)物，同時(shí)隨著多核巨細(xì)胞的大量生成，巨細(xì)胞中央核數(shù)目為 2-20 個(gè)，發(fā)生細(xì)胞變性。細(xì)胞物中的病變效應(yīng)一般出現(xiàn)在接種后的 14-21 天，但病毒在通過(guò)數(shù)次傳代培養(yǎng)、大量的情況下，能夠在 3-15 天產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)。這種細(xì)胞病變效應(yīng)不僅能夠產(chǎn)生于的對(duì)應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)物中，還能產(chǎn)生于其他的某些細(xì)胞培養(yǎng)物中，比如小鼠、大鼠和倉(cāng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)；人、犬、豬、牛的脈絡(luò)叢原代細(xì)胞；豬源、牛源的脈絡(luò)叢傳代。這些經(jīng)過(guò)接連侵染的細(xì)胞產(chǎn)物會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)化的明顯特點(diǎn)，即喪失了接觸抑制，生長(zhǎng)加快[117]。.2 分子生物學(xué)特征.2.1 CAEV 的基因組CAEV 的完整基因組大小為 9.2kb，由兩條單股正鏈 RNA 構(gòu)成�；蚪M從 5’端到依次為 5’-LTR-gag-pol-env-LTR-3’[44]。其中，除編碼結(jié)構(gòu)蛋白的 gag 基因、pol 基因v 基因，CAEV 還具有編碼調(diào)節(jié)蛋白的 tat 基因和 rev 基因，編碼輔助蛋白的 vif 基病毒的感染及復(fù)制過(guò)程中，這些基因所編碼的調(diào)節(jié)蛋白和輔助蛋白是不可或缺的存]。CAEV 完整的基因組結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖 2。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2662612