【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是引起豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病原。九十年代初期,I型和II型PRRSV幾乎同時在歐洲和北美出現(xiàn)。1996年,中國大陸首次分離到PRRSV。經(jīng)過二十多年的演化,PRRSV的多樣性更加復(fù)雜。為了了解我國不同基因亞型新發(fā)PRRSV的流行情況和生物學(xué)特性,本研究在2014-2018年從全國14個省市疑似PRRSV感染的1900份病料中檢測分離PRRSV。本研究共測定了321株P(guān)RRSV的ORF5基因和50株P(guān)RRSV的全基因組序列,鑒定了5種類型的PRRSV,分別是NADC30-like PRRSV(Sublineage 1.8)、NADC34-like PRRSV(1-7-4,Sublineage 1.5)、QYYZ-like PRRSV(Sublineage 3.5)、RespPRRSV MLV like PRRSV(Sublineage 5.1)和Sublineage 8.7 PRRSV,其中NADC34-like PRRSV是首次在中國發(fā)現(xiàn)。本章節(jié)主要完成了以下6個內(nèi)容:(1)本研究根據(jù)Shi et al(2010)的報道,進(jìn)一步將Lineage 1 PRRSV分為9個Sublineage(1.1-1.9),NADC30-like PRRSV屬于Sublineage 1.8。Sublineage 1.8 PRRSV具有更快的變異速度和更高的重組頻率,毒株之間的基因組同源性較低,重組模式復(fù)雜多樣,重組的位置主要集中于非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)和次要結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)。(2)2017年,本研究首次分離到2株Nsp2蛋白存在100個aa連續(xù)缺失的新毒株LNWK96和LNWK130,2株毒株均為重組病毒,遺傳演化分析顯示,該類毒株屬于Sublineage 1.5,它們與美國流行的NADC34毒株同源性最高,也被稱為NADC34-like PRRSV或1-7-4分支PRRSV,它們可能起源于北美。(3)本研究對Lineage 3 PRRSV進(jìn)一步分類,分為Sublineage 3.1-3.5,Sublineage 3.5 PRRSV具有較高的重組頻率,與本地毒株重組后廣泛存在于我國的南方地區(qū)。通過對過度毒株FJ-1和FJFS的遺傳演化分析,證實了大陸地區(qū)的Sublineage 3.5 PRRSV起源于臺灣地區(qū)的Sublineage 3.2。(4)Lineage 5 PRRSV疫苗在我國應(yīng)用較早,我國分離的Lineage 5 PRRSV均屬于Sublineage 5.1,它們與ATCC VR2332和疫苗株RespPRRS MLV具有較高的核苷酸同源性。Sublineage 5.1 PRRSV在我國變異較小,這類毒株的出現(xiàn)可能和疫苗的應(yīng)用有關(guān)。(5)本研究將Sublineage 8.7 PRRSV進(jìn)一步分為Sublineage 8.7.1(CH-1a like PRRSV)、Sublineage 8.7.2(HP-PRRSV like PRRSV)和Sublineage 8.7.3(HP-PRRSV),2006年以后,HP-PRRSV席卷全國各省,然而,近年來Sublineage 8.7.3 PRRSV已經(jīng)發(fā)生較大變異,這類毒株的致病性和當(dāng)前疫苗的保護(hù)效果尚不清楚(6)Sublineage 1.8 PRRSV是我國新出現(xiàn)的PRRSV,而且在短時間內(nèi)已經(jīng)成為我國的主要流行毒株,本研究對Sublineage 1.8 PRRSV SD53-1603株進(jìn)行了致病性和免疫保護(hù)效果評估,結(jié)果表明SD53-1603株對豬只具有中等致病性,當(dāng)前商品化疫苗HuN4-F112可以提供一定程度的保護(hù)。為了尋找PRRSV的遺傳演化規(guī)律,本研究對相對封閉的大型養(yǎng)殖集團(tuán)進(jìn)行了長達(dá)4年的PRRSV監(jiān)測,從該大型養(yǎng)殖集團(tuán)的不同豬場共采集了338份疑似PRRSV感染的組織或血清,鑒定并測序了119株P(guān)RRSV的ORF5序列和34株P(guān)RRSV的全基因組序列。鑒定了4種類型的PRRSV存在于該大型養(yǎng)殖集團(tuán),分別是NADC30-like PRRSV(Sublineage 1.8)、QYYZ-like PRRSV(Sublineage 3.5)、RespPRRSV MLV like PRRSV(Sublineage 5.1)和HP-PRRSV(Sublineag 8.7)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)前如此復(fù)雜的重組模式是逐步形成的,同一毒株在不同的位置發(fā)生重組,增加重組的多樣性,為病毒的生存提供更多的可能。該集團(tuán)RespPRRS MLV like PRRSV是RespPRRS MLV疫苗的返強(qiáng)毒株,確定了5個毒力相關(guān)位點和4個返強(qiáng)相關(guān)位點。大型養(yǎng)殖集團(tuán)內(nèi)PRRSV的分布和傳播與豬只的運(yùn)輸關(guān)系和疫苗的使用密切相關(guān)。弱毒疫苗是防控PRRS的主要方法之一,但目前使用PRRS活疫苗的缺陷是疫苗株抗體不能與野毒株抗體有效區(qū)分,不利于疫苗免疫效果的評價和疫病的凈化。為了解決這一難題,在本實驗室已建立的針對M蛋白(1C8表位)的阻斷ELISA抗體監(jiān)測方法基礎(chǔ)上,本研究構(gòu)建了NADC30-like PRRSV SD53-1603株的感染性克隆,并成功拯救出子代病毒。運(yùn)用該感染性克隆平臺,構(gòu)建了12種M蛋白1C8表位aa缺失或替換的缺陷型質(zhì)粒,通過病毒拯救,成功獲得5種缺失病毒。經(jīng)過體外驗證后,將這5種缺陷型病毒傳至65代進(jìn)行免疫實驗,實驗結(jié)果表明,rSD53-1603-Δ3SΔ4S-M65與母本毒株rSD53-1603-M65產(chǎn)生針對1C8表位的特異性抗體差異極顯著,以上結(jié)果為PRRSV DIVA疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
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中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言O(shè)RF7 的下游，大約 150 nt。3’UTR 同樣具有遺傳多樣性，I 型和 II 型 PRRSV 3’UTR 的 nt同源性大約為 70 %，而同一基因型的 3’UTR nt 同源性大約為 96 % (Beerens et al., 2007; Choiet al., 2006; Verheije et al., 2002; Yin et al., 2013)。5’UTR 的下游是 1 個大的編碼復(fù)制酶的 ORF。ORF1a/b 有 1 個共同的翻譯起點，但是存在 2 個核糖體移碼位點 (Ribosomal frame- shift，RFS)，分別位于 nsp2 基因的 3,889 nt 處(RFS1)和nsp8/9的7,695 nt (RFS2) 處 (參考毒株為VR-2332) (Fang et al., 2012; Li et al., 2015;Meulenberg et al., 1993b)。在 RFS1 位點產(chǎn)生 2 個蛋白，分別是 Nsp2N (-1 RFS, ~7 % 的效率)(Li et al., 2014a) 和 Nsp2TF (-2 RFS, ~20 % 的效率) (Fang et al., 2012)。復(fù)制酶多聚蛋白通過RFSs 加工成至少 16 個 Nsps，其中 4 個具有蛋白酶活性，包括木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶 (Papain-like cysteine proteinases, PLP1α, PLP1β 和 PLP2)和絲氨酸蛋白酶 (Serineproteinase, SP) (Snijder et al., 2013)。PLP1α 和 PLP1β 的功能是分別切割 Nsp1α/Nsp1β 和Nsp1β/Nsp2 的連接處 (Han et al., 2009; Snijder et al., 2013)。PLP2 的功能是切割 Nsp2/Nsp3的連接處 (Han et al., 2009; Snijder et al., 2013)。SP負(fù)責(zé)切割剩下的Nsps (Nsp3~12) (Han et al.,2009; Snijder et al., 2013)。ORF1a 編碼多聚蛋白 pp1a，進(jìn)一步加工形成 Nsp1α/β、Nsp2~6、Nsp7α/β 和 Nsp8 (Meulenberg et al., 1993b; Nelsen et al., 1999)。ORF1b 編碼多聚蛋白 pp1ab，進(jìn)一步加工形成 Nsp9~12 (Meulenberg et al., 1993b; Nelsen et al., 1999)。

35 SX2-1607 2016.07.28 Shanxi 76 XNF40-1809 2018.09.03 Guangdong36 TZJ11-1707 2017.07.28 Jilin 77 XNF41-1809 2018.09.03 Guangdong37 TZJ12-1707 2017.07.28 Jilin 78 XNF86-1803 2018.03.27 Guangdong38 TZJ31-1711 2017.11.14 Heilongjiang 79 XNF9-1804 2018.04.14 Guangdong39 WK101b-1711 2017.11.08 Liaoning 80 ZD11-1810 2018.10.10 Heilongjiang40 WK102b-1711 2017.11.08 Liaoning 81 ZD13-1810 2018.10.10 Heilongjiang41 WK108a-1711 2017.11.29 Liaoning 82 ZD14-1810 2018.10.10 HeilongjiangaPRRSV could be isolated from PAM and Marc-145 cells;bPRRSV could be isolated from PAM cells2.3.2.2 NADC30-like PRRSV 的遺傳演化分析2012 年，NADC30-like PRRSV 在中國首次被檢測到 (周峰等，2014)，直到 2016 年，，大量的毒株在中國各大豬場出現(xiàn)。與中國存在的 HP-PRRSV 不同，NADC30-like PRRSV 具有更復(fù)雜的多樣性和更多樣的重組模式。本研究對 GenBank 中所有的中國分離的 NADC30-like PRRSV 和本研究檢測到的 82 株 NADC30-like PRRSV 進(jìn)行遺傳演化分析，發(fā)現(xiàn) 2016-2018 年間，本研究檢測到的 NADC30-like PRRSV 遍布整個 Sublineage 1.8 分支，Sublineage 1.8 分支用灰色背景顯示，本研究中檢測到的 NADC30-like PRRSV 用紅色顯示 (圖 2.2)。當(dāng)前該分支的 diversity 是 7.6 %，這與報道的 NADC30-like PRRSV 復(fù)雜的遺傳多樣性相吻合。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.651


本文編號：2662730