【摘要】：牛病毒性腹瀉病(Bovine viral diarrhea,BVD)是嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的重要傳染病之一。研究病毒對宿主的感染機(jī)制有助于該病的防控。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出4種可能與BVDV存在相互作用、最具有后續(xù)研究價(jià)值的互作蛋白,分別是波形蛋白、α-輔肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白。有大量的研究表明,波形蛋白在許多病毒的感染中發(fā)揮著重要的作用。本研究擬確定波形蛋白在BVDV感染MDBK細(xì)胞時(shí)的作用,該研究對于深入了解BVDV的感染機(jī)制具有重要的理論價(jià)值。本研究首先確定BVDV感染是否對MDBK細(xì)胞的波形蛋白產(chǎn)生影響,通過實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測BVDV感染后MDBK細(xì)胞中波形蛋白的轉(zhuǎn)錄水平,Western blot檢測波形蛋白的水平。結(jié)果表明:在BVDV感染早期,MDBK細(xì)胞中波形蛋白的轉(zhuǎn)錄和蛋白量明顯降低。激光共聚焦檢測確定波形蛋白與BVDV結(jié)構(gòu)蛋白E2共定位。推測在BVDV侵染過程中與波形蛋白發(fā)生了作用。其次,為了確定破壞和敲低波形蛋白對BVDV感染MDBK時(shí)病毒復(fù)制的影響。采用短發(fā)夾RNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),設(shè)計(jì)構(gòu)建靶向波形蛋白的特異shRNA質(zhì)粒,利用shRNA敲低MDBK細(xì)胞中波形蛋白的表達(dá),利用ACY破壞波形蛋白結(jié)構(gòu),然后感染BVDV,確定破壞和敲低波形蛋白對病毒復(fù)制的影響。結(jié)果表明,成功構(gòu)建了3組靶向波形蛋白的特異shRNA質(zhì)粒,均敲低了MDBK的內(nèi)源性波形蛋白的表達(dá)。在MDBK細(xì)胞上波形蛋白被敲低或破壞時(shí),均影響了BVDV的復(fù)制,降低了病毒滴度。為了進(jìn)一步研究重組波形蛋白和波形蛋白單抗阻斷對BVDV感染MDBK時(shí)病毒復(fù)制的影響。PCR擴(kuò)增波形蛋白基因,構(gòu)建Vim-pET-28a表達(dá)質(zhì)粒,誘導(dǎo)表達(dá),鎳柱純化目的蛋白。分別應(yīng)用重組波形蛋白和波形蛋白單抗鋪覆MDBK細(xì)胞,檢測BVDV感染MDBK時(shí)病毒復(fù)制情況。結(jié)果表明,成功獲得原核表達(dá)的波形蛋白。重組波形蛋白和波形蛋白單抗阻斷均對BVDV的早期復(fù)制產(chǎn)生影響,明顯降低了病毒滴度。綜上所述,BVDV感染抑制了MDBK中波形蛋白的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。波形蛋白被敲低或破壞后,BVDV的復(fù)制水平下降。重組波形蛋白和波形蛋白單抗阻斷后,均影響了BVDV的復(fù)制,降低了病毒滴度。BVDV感染MDBK細(xì)胞時(shí)波形蛋白與病毒的復(fù)制具有相關(guān)性。本研究有助于揭示BVDV的感染機(jī)制,對于BVDV的防控奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠的二抗于平穩(wěn)勻速次清洗時(shí)間不少于15 min。根據(jù)DAB-H2 E2蛋白和波形蛋白進(jìn)行共定位中生長到60-70%，吸去培養(yǎng)液，，PBS洗3三次，棄上清，加入4%多聚甲醛，室溫00通透，加入含1%牛血清白蛋白封閉1 h%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見244 bp的

圖2-2.接毒后不同時(shí)間段波形蛋白mRNA表達(dá)量.Vimentin mRNA expression at different time after infectioern blot結(jié)果染BVDV 24h時(shí)，波形蛋白的定量Western blot結(jié)明顯減少。圖2-3 .BVDV感染24h時(shí)對波形蛋白的影響Fig 2-3.BVDV infection 24h on vimentinDV E2蛋白的共定位
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23

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本文編號(hào)：2661660