【摘要】：牛病毒性腹瀉病(Bovine viral diarrhea,BVD)是嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)的重要傳染病之一。研究病毒對宿主的感染機制有助于該病的防控。本實驗室前期篩選出4種可能與BVDV存在相互作用、最具有后續(xù)研究價值的互作蛋白,分別是波形蛋白、α-輔肌動蛋白、肌動蛋白和微管蛋白。有大量的研究表明,波形蛋白在許多病毒的感染中發(fā)揮著重要的作用。本研究擬確定波形蛋白在BVDV感染MDBK細胞時的作用,該研究對于深入了解BVDV的感染機制具有重要的理論價值。本研究首先確定BVDV感染是否對MDBK細胞的波形蛋白產(chǎn)生影響,通過實時定量PCR(qRT-PCR)檢測BVDV感染后MDBK細胞中波形蛋白的轉錄水平,Western blot檢測波形蛋白的水平。結果表明:在BVDV感染早期,MDBK細胞中波形蛋白的轉錄和蛋白量明顯降低。激光共聚焦檢測確定波形蛋白與BVDV結構蛋白E2共定位。推測在BVDV侵染過程中與波形蛋白發(fā)生了作用。其次,為了確定破壞和敲低波形蛋白對BVDV感染MDBK時病毒復制的影響。采用短發(fā)夾RNA介導的RNA干擾技術,設計構建靶向波形蛋白的特異shRNA質粒,利用shRNA敲低MDBK細胞中波形蛋白的表達,利用ACY破壞波形蛋白結構,然后感染BVDV,確定破壞和敲低波形蛋白對病毒復制的影響。結果表明,成功構建了3組靶向波形蛋白的特異shRNA質粒,均敲低了MDBK的內(nèi)源性波形蛋白的表達。在MDBK細胞上波形蛋白被敲低或破壞時,均影響了BVDV的復制,降低了病毒滴度。為了進一步研究重組波形蛋白和波形蛋白單抗阻斷對BVDV感染MDBK時病毒復制的影響。PCR擴增波形蛋白基因,構建Vim-pET-28a表達質粒,誘導表達,鎳柱純化目的蛋白。分別應用重組波形蛋白和波形蛋白單抗鋪覆MDBK細胞,檢測BVDV感染MDBK時病毒復制情況。結果表明,成功獲得原核表達的波形蛋白。重組波形蛋白和波形蛋白單抗阻斷均對BVDV的早期復制產(chǎn)生影響,明顯降低了病毒滴度。綜上所述,BVDV感染抑制了MDBK中波形蛋白的轉錄與表達。波形蛋白被敲低或破壞后,BVDV的復制水平下降。重組波形蛋白和波形蛋白單抗阻斷后,均影響了BVDV的復制,降低了病毒滴度。BVDV感染MDBK細胞時波形蛋白與病毒的復制具有相關性。本研究有助于揭示BVDV的感染機制,對于BVDV的防控奠定了基礎。
【圖文】：

氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠的二抗于平穩(wěn)勻速次清洗時間不少于15 min。根據(jù)DAB-H2 E2蛋白和波形蛋白進行共定位中生長到60-70%，吸去培養(yǎng)液，，PBS洗3三次，棄上清，加入4%多聚甲醛，室溫00通透，加入含1%牛血清白蛋白封閉1 h%瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見244 bp的

圖2-2.接毒后不同時間段波形蛋白mRNA表達量.Vimentin mRNA expression at different time after infectioern blot結果染BVDV 24h時，波形蛋白的定量Western blot結明顯減少。圖2-3 .BVDV感染24h時對波形蛋白的影響Fig 2-3.BVDV infection 24h on vimentinDV E2蛋白的共定位
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

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