【摘要】：αs1-酪蛋白(Alpha S1 Casein,CSN1S1)是乳蛋白中一種重要的蛋白質(zhì),可以為動物體的生長發(fā)育提供活性肽、必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì),也能夠調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞等多種細胞的生理狀態(tài)及功能。因此,探究αs1-酪蛋白基因?qū)δ躺窖蛉榈鞍缀铣傻恼{(diào)控作用有極其重要的意義。本研究通過克隆得到奶山羊CSN1S1基因的CDS區(qū),并構(gòu)建了CSN1S1基因重組腺病毒過表達載體,同時在線設(shè)計并合成靶向CSN1S1基因的特異性siRNA。在山羊乳腺上皮細胞中分別對CSN1S1基因進行過表達和干擾,通過RT-qPCR和Western Blot等方法檢測乳蛋白相關(guān)基因表達量及部分乳蛋白表達量的變化,為進一步明確αs1-酪蛋白基因在乳蛋白合成中的功能奠定一定的理論基礎(chǔ)。以下為本研究主要結(jié)果:1.采集泌乳盛期西農(nóng)薩能奶山羊乳腺組織,提取總RNA,根據(jù)GenBank中收錄的Capra hircus的CSN1S1基因序列(KT253650.1)來設(shè)計引物,利用RT-PCR技術(shù)克隆得到山羊CSN1S1基因CDS序列,其長度為642bp,編碼213個氨基酸。生物信息學分析得出,山羊CSN1S1基因CDS區(qū)序列與Ovis aries(FJ440845.1)、Bos taurus(EU908730.1)、Mus musculus(AF275367.1)、Sus scrofa(NM_001004029.2)、Homo sapiens(NM_001890.2)的同源性分別為:98.91%、97.83%、84.87%、92.52%以及85.69%。2.構(gòu)建含目的基因的同源重組質(zhì)粒pAdEasy-CSN1S1,轉(zhuǎn)染293A細胞,感染擴增四代得到高滴度腺病毒,滴度為10~8 U/mL。通過不同體積的病毒液感染山羊乳腺上皮細胞,確定病毒最佳感染復數(shù)(MOI)為200。病毒感染山羊乳腺上皮細胞48 h后收集細胞總RNA或總蛋白,RT-qPCR結(jié)果顯示,CSN1S1基因表達量顯著上調(diào)(P0.01),CSN2基因表達顯著下調(diào)(P0.05),CSN1S2、CSN3、LALBA、BLG的表達水平無顯著變化;Western blot結(jié)果顯示,過表達CSN1S1基因后,αs1-酪蛋白表達量顯著升高(P0.05),β-酪蛋白表達量顯著下降(P0.05),αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白及β-乳球蛋白表達水平無顯著變化。3.根據(jù)CSN1S1基因CDS區(qū)序列,設(shè)計靶向CSN1S1基因的特異性siRNA,并轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞,篩選得到干擾效率最佳的siR-507(P0.01)。干擾CSN1S1基因后,RT-qPCR結(jié)果顯示,CSN2基因表達水平顯著上調(diào)(P0.05),CSN1S2、CSN3、LALBA、BLG基因的mRNA水平無顯著變化;Western blot結(jié)果顯示,αs1-酪蛋白表達量被抑制(P0.05);β-酪蛋白表達水平顯著上調(diào)(P0.05),αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白及β-乳球蛋白的表達無明顯變化。綜上所述,本研究成功克隆得到了奶山羊αs1-酪蛋白基因的CDS區(qū),構(gòu)建了腺病毒過表達載體,并感染山羊乳腺上皮細胞以過表達CSN1S1基因,可導致CSN2基因的mRNA表達水平及蛋白表達顯著下調(diào),干擾αs1-酪蛋白基因能夠顯著上調(diào)CSN2基因及β-酪蛋白表達。本研究為明確CSN1S1基因在西農(nóng)薩能奶山羊乳腺細胞乳蛋白合成中的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。
【圖文】：

乳腺是一個高度組織化的器官，通過它向母體提供營養(yǎng)物質(zhì)，對于動物機體生長、育和健康至關(guān)重要。乳腺是哺乳動物體內(nèi)特殊的腺體，具有特殊的泌乳功能，乳腺育和哺乳動物產(chǎn)生的泌乳行為是其重要特征，乳腺屬于外分泌腺體，由哺乳動物皮中的汗腺衍生而來(Antonio J et al. 2017)。在乳的形成過程中，腺泡承擔著重要任務(wù)，泡是泌乳的最基本結(jié)構(gòu)，在乳腺中存在大量的腺泡，它是由乳腺上皮細胞構(gòu)成，單乳腺上皮形成了中空的腔體，這個空腔被稱為腺泡腔，在泌乳過程中，它將各種營物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乳(張倡琿等 2017)。卵巢激素促進乳腺的生長，乳腺在卵巢素的作用下始發(fā)育，青春期的腺泡上皮細胞最初排列緊密，到泌乳期后，腺泡變得飽滿，胞質(zhì)盈，胞間質(zhì)減少(Bai G et al. 2016)，，形態(tài)變化如圖 1.1 所示，而到了干奶期，腺泡也小，胞間質(zhì)會增多。乳腺腺泡的發(fā)育從青春期經(jīng)歷腺泡芽、初級腺泡、成熟腺泡三階段，其中的單層分泌細胞也就是乳腺上皮細胞，是腺泡中用以分泌乳汁的，也就泌乳的最基本單位(Liu Y et al. 2010)。

泌乳山羊來說，泌乳細胞會在分娩期和泌乳高峰期內(nèi)大量的增殖，泌乳會降低，分析原因可能是因為乳腺分泌組織的萎縮從而導致細胞凋亡，低。乳腺細胞不僅能夠合成非必需氨基酸，還能提供合成乳蛋白所ky L et al. 2017)。乳腺合成的乳蛋白進入動物機體循環(huán)系統(tǒng)的很少，基本程，從終導管排出體外。對動物靜脈注射特異性蛋白標記的氨基酸（1行測定，對乳腺進行動靜脈差的測定等研究都能夠證明，酪蛋白、α-乳清蛋白等都是由乳腺分泌細胞利用血液中的氨基酸或小肽從頭合成的(Chi6)。編碼乳蛋白的相關(guān)基因表達具有明顯組織特異性和一定的階段特異性的合成在乳腺上皮細胞中特定進行，表達量大，并且發(fā)生在相當長一段內(nèi)，即哺乳母體即將分娩前后的時那段時期(Bohl M et al. 2016)。乳蛋白達效率和組織特異性主要是由順式作用元件包括一些啟動子、增強子、位點控制區(qū)等以及與順勢元件相結(jié)合的反式作用因子，例如轉(zhuǎn)錄因子和所決定。有關(guān)乳蛋白質(zhì)基因結(jié)構(gòu)研究及其表達調(diào)控的相關(guān)研究已取得巨蛋白基因,如牛的各種酪蛋白基因、α-乳清蛋白基因（LALBA）、β-乳球蛋白（被克隆得出，并得到了全部序列(ALFEREZ et al. 2001)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S827

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本文編號：2661970