發(fā)布時(shí)間：2020-05-13 12:38

【摘要】：αs1-酪蛋白(Alpha S1 Casein,CSN1S1)是乳蛋白中一種重要的蛋白質(zhì),可以為動(dòng)物體的生長(zhǎng)發(fā)育提供活性肽、必需氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),也能夠調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的生理狀態(tài)及功能。因此,探究αs1-酪蛋白基因?qū)δ躺窖蛉榈鞍缀铣傻恼{(diào)控作用有極其重要的意義。本研究通過(guò)克隆得到奶山羊CSN1S1基因的CDS區(qū),并構(gòu)建了CSN1S1基因重組腺病毒過(guò)表達(dá)載體,同時(shí)在線(xiàn)設(shè)計(jì)并合成靶向CSN1S1基因的特異性siRNA。在山羊乳腺上皮細(xì)胞中分別對(duì)CSN1S1基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾,通過(guò)RT-qPCR和Western Blot等方法檢測(cè)乳蛋白相關(guān)基因表達(dá)量及部分乳蛋白表達(dá)量的變化,為進(jìn)一步明確αs1-酪蛋白基因在乳蛋白合成中的功能奠定一定的理論基礎(chǔ)。以下為本研究主要結(jié)果:1.采集泌乳盛期西農(nóng)薩能奶山羊乳腺組織,提取總RNA,根據(jù)GenBank中收錄的Capra hircus的CSN1S1基因序列(KT253650.1)來(lái)設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR技術(shù)克隆得到山羊CSN1S1基因CDS序列,其長(zhǎng)度為642bp,編碼213個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析得出,山羊CSN1S1基因CDS區(qū)序列與Ovis aries(FJ440845.1)、Bos taurus(EU908730.1)、Mus musculus(AF275367.1)、Sus scrofa(NM_001004029.2)、Homo sapiens(NM_001890.2)的同源性分別為:98.91%、97.83%、84.87%、92.52%以及85.69%。2.構(gòu)建含目的基因的同源重組質(zhì)粒pAdEasy-CSN1S1,轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,感染擴(kuò)增四代得到高滴度腺病毒,滴度為10~8 U/mL。通過(guò)不同體積的病毒液感染山羊乳腺上皮細(xì)胞,確定病毒最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為200。病毒感染山羊乳腺上皮細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞總RNA或總蛋白,RT-qPCR結(jié)果顯示,CSN1S1基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.01),CSN2基因表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05),CSN1S2、CSN3、LALBA、BLG的表達(dá)水平無(wú)顯著變化;Western blot結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)CSN1S1基因后,αs1-酪蛋白表達(dá)量顯著升高(P0.05),β-酪蛋白表達(dá)量顯著下降(P0.05),αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白及β-乳球蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化。3.根據(jù)CSN1S1基因CDS區(qū)序列,設(shè)計(jì)靶向CSN1S1基因的特異性siRNA,并轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞,篩選得到干擾效率最佳的siR-507(P0.01)。干擾CSN1S1基因后,RT-qPCR結(jié)果顯示,CSN2基因表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05),CSN1S2、CSN3、LALBA、BLG基因的mRNA水平無(wú)顯著變化;Western blot結(jié)果顯示,αs1-酪蛋白表達(dá)量被抑制(P0.05);β-酪蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05),αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白及β-乳球蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化。綜上所述,本研究成功克隆得到了奶山羊αs1-酪蛋白基因的CDS區(qū),構(gòu)建了腺病毒過(guò)表達(dá)載體,并感染山羊乳腺上皮細(xì)胞以過(guò)表達(dá)CSN1S1基因,可導(dǎo)致CSN2基因的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)顯著下調(diào),干擾αs1-酪蛋白基因能夠顯著上調(diào)CSN2基因及β-酪蛋白表達(dá)。本研究為明確CSN1S1基因在西農(nóng)薩能奶山羊乳腺細(xì)胞乳蛋白合成中的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。
【圖文】：

乳腺是一個(gè)高度組織化的器官，通過(guò)它向母體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)于動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)、育和健康至關(guān)重要。乳腺是哺乳動(dòng)物體內(nèi)特殊的腺體，具有特殊的泌乳功能，乳腺育和哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的泌乳行為是其重要特征，乳腺屬于外分泌腺體，由哺乳動(dòng)物皮中的汗腺衍生而來(lái)(Antonio J et al. 2017)。在乳的形成過(guò)程中，腺泡承擔(dān)著重要任務(wù)，泡是泌乳的最基本結(jié)構(gòu)，在乳腺中存在大量的腺泡，它是由乳腺上皮細(xì)胞構(gòu)成，單乳腺上皮形成了中空的腔體，這個(gè)空腔被稱(chēng)為腺泡腔，在泌乳過(guò)程中，它將各種營(yíng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乳(張倡琿等 2017)。卵巢激素促進(jìn)乳腺的生長(zhǎng)，乳腺在卵巢素的作用下始發(fā)育，青春期的腺泡上皮細(xì)胞最初排列緊密，到泌乳期后，腺泡變得飽滿(mǎn)，胞質(zhì)盈，胞間質(zhì)減少(Bai G et al. 2016)，，形態(tài)變化如圖 1.1 所示，而到了干奶期，腺泡也小，胞間質(zhì)會(huì)增多。乳腺腺泡的發(fā)育從青春期經(jīng)歷腺泡芽、初級(jí)腺泡、成熟腺泡三階段，其中的單層分泌細(xì)胞也就是乳腺上皮細(xì)胞，是腺泡中用以分泌乳汁的，也就泌乳的最基本單位(Liu Y et al. 2010)。

泌乳山羊來(lái)說(shuō)，泌乳細(xì)胞會(huì)在分娩期和泌乳高峰期內(nèi)大量的增殖，泌乳會(huì)降低，分析原因可能是因?yàn)槿橄俜置诮M織的萎縮從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，低。乳腺細(xì)胞不僅能夠合成非必需氨基酸，還能提供合成乳蛋白所ky L et al. 2017)。乳腺合成的乳蛋白進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)的很少，基本程，從終導(dǎo)管排出體外。對(duì)動(dòng)物靜脈注射特異性蛋白標(biāo)記的氨基酸（1行測(cè)定，對(duì)乳腺進(jìn)行動(dòng)靜脈差的測(cè)定等研究都能夠證明，酪蛋白、α-乳清蛋白等都是由乳腺分泌細(xì)胞利用血液中的氨基酸或小肽從頭合成的(Chi6)。編碼乳蛋白的相關(guān)基因表達(dá)具有明顯組織特異性和一定的階段特異性的合成在乳腺上皮細(xì)胞中特定進(jìn)行，表達(dá)量大，并且發(fā)生在相當(dāng)長(zhǎng)一段內(nèi)，即哺乳母體即將分娩前后的時(shí)那段時(shí)期(Bohl M et al. 2016)。乳蛋白達(dá)效率和組織特異性主要是由順式作用元件包括一些啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、位點(diǎn)控制區(qū)等以及與順勢(shì)元件相結(jié)合的反式作用因子，例如轉(zhuǎn)錄因子和所決定。有關(guān)乳蛋白質(zhì)基因結(jié)構(gòu)研究及其表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究已取得巨蛋白基因,如牛的各種酪蛋白基因、α-乳清蛋白基因（LALBA）、β-乳球蛋白（被克隆得出，并得到了全部序列(ALFEREZ et al. 2001)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S827

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本文編號(hào)：2661970