【摘要】：山東壽光雞群中的ALV感染較為嚴(yán)重,對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè),毒株的分離鑒定、基因組特征分析以及多克隆抗體的制備等研究。從該雞群采集樣品,經(jīng)ALV p27抗原ELISA檢測(cè),陽(yáng)性率為54%。陽(yáng)性血漿接種DF-1細(xì)胞,提細(xì)胞基因組cDNA,用ALV特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增env基因,與國(guó)內(nèi)外A、B、C、D、E、J亞群參考株同源性為57.1%~93.2%,其中,與內(nèi)源性E亞群參考株為93.2%,由于DF-1細(xì)胞可以抗內(nèi)源性病毒,所以可以排除E亞群;與K亞群參考株的核苷酸為94.1%~99.4%,進(jìn)化樹(shù)分析顯示,10個(gè)分離株與K亞群參考株親緣關(guān)系最近,因此,初步確定為ALV-K,分別命名為hz01~hz10。根據(jù)遺傳關(guān)系,選取3個(gè)不在同一分支上的分離株,將感染該病毒的雞解剖后,表觀未看到癥狀,病理組織觀察發(fā)現(xiàn),肝臟、脾臟、卵巢、肺臟、腎臟均有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和出血,其中心臟最為嚴(yán)重,出現(xiàn)了部分細(xì)胞變性壞死;超微結(jié)構(gòu)病理變化為,肝臟和脾臟中出現(xiàn)淋巴細(xì)胞核膜褶皺,胞質(zhì)中含有液泡,見(jiàn)到多個(gè)大小為200nm左右的病毒粒子,肝臟中形成淋巴小結(jié)。將hz01、hz04、hz06毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序,其前病毒cDNA全基因組序列長(zhǎng)度分別為7482bp、7491bp、7478bp,與K亞群參考株相比,除R區(qū)外,其余基因均有不同程度的增長(zhǎng)或縮短。gag、pol、gp37基因及R、U5區(qū)與大多參考毒株核苷酸序列同源性都在95%以上,而gp85基因、U3區(qū)差異顯著。3個(gè)分離株的gp85和gp37核苷酸均為1005bp、612bp,編碼相應(yīng)的氨基酸序列大小分別是:335aa、204aa。分離株之間的gp85核苷酸同源性為97.2%~99.0%,氨基酸同源性為95.2%~98.8%;與國(guó)內(nèi)外各個(gè)K亞群參考株核苷酸同源性為94.7%~99.4%,氨基酸同源性為91.3%~99.6%,與GDFX0602、GDFX0603的氨基酸同源性最高,與HB2015032、JS11C1同源性最低,雖均為ALV-K,分離株間的gp85氨基酸序列存在較小的差異,而與各個(gè)K亞群參考株存在不同程度差異,主要表現(xiàn)在個(gè)別位點(diǎn)的突變,沒(méi)有插入、缺失等變化,這些氨基酸突變可能會(huì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。LTR長(zhǎng)度分別為276bp、280bp、276bp,與內(nèi)源性病毒相似,同源性最高為95.3%~98.2%,與外源性病毒較低為58.5%~64.3%。與K亞群相比,其長(zhǎng)度差別主要表現(xiàn)在U3區(qū),變異也主要出現(xiàn)在該區(qū),分離株之間的核苷酸同源性為97.2%~98.9%,與國(guó)內(nèi)外參考株同源性為36.4%~100%,從遺傳進(jìn)化樹(shù)上來(lái)看,與HB2015032、Sp-53、JS11C1、JS14CZ01親緣關(guān)系最遠(yuǎn),變異較大,堿基插入、缺失、突變較多。3個(gè)分離株的全基因序列與GDFX0601,GDFX0602和GDFX0603參考株同源性極高,雖從不同地區(qū)分離出來(lái)的,但可能從同一毒株變異而來(lái),而與HB2015032、Sp-53、JS11C1、JS14CZ01的同源性較低,均為不同的進(jìn)化背景。ALV-K可能已經(jīng)存在于山東本地雞群中很長(zhǎng)一段時(shí)間,具有毒株多樣化趨勢(shì)。因此,加強(qiáng)對(duì)ALV-K生物學(xué)特性的深入分析,了解不同地區(qū)ALV-K的變異差異,將有益于中國(guó)本土雞的ALV根除計(jì)劃。用ALV-K-gp85特異性引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增出1002bp大小的ALV-K-gp85基因片段,建立重組質(zhì)粒pET-32a-ALV-K-gp85,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,經(jīng)可溶性分析,該蛋白主要以包涵體的形式存在,用Ni-NTA親和層析介質(zhì)對(duì)其純化,進(jìn)行SDSPAGE和Western分析,出現(xiàn)了1條相對(duì)分子量為53kD左右的條帶,BCA法測(cè)得的蛋白濃度為3.1436ug/uL。純化后的蛋白作為抗原免疫家兔,制備多克隆抗體。經(jīng)ELISA方法檢測(cè),抗體效價(jià)達(dá)到1:12800,進(jìn)行IFA檢測(cè),制備的多克隆抗體可識(shí)別ALV-K感染。為制備亞單位疫苗和建立快速檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ),為今后防控、凈化該病提供可能。綜上,分離得到10株ALV-K。hz01、hz04、hz06分離株變異主要表現(xiàn)在gp85基因和U3區(qū)上,gag、pol、gp37基因以及U5、R區(qū)比較保守。成功表達(dá)并純化了ALVK-gp85蛋白,并得到了其多克隆抗體。
【圖文】：

顯得更加復(fù)雜化（崔治中，2015；王鑫等，20Dong et al., 2015；Shao et al., 2017；Li et al., 201~65%的蛋白質(zhì)，30%~50%的脂類，2.2% RNA 分，內(nèi)部的電子致密核心、中層膜和外部的囊膜核心，為核糖核蛋白與核殼構(gòu)成的核蛋白復(fù)合物NA，能夠編碼蛋白酶（PR）、整合酶（IN）和反在病毒 RNA 形成 DNA 過(guò)程中發(fā)揮重要作用；衣殼，直徑約 60nm；外面是病毒的囊膜，由膜表構(gòu)成，有放射狀突起，直徑約為 8nm（圖 1）。其密度為 1.15~ 1.17g/cm3，分子量約為 10×106kD。

山東省某地方品種雞 ALV-K的分離鑒定及其全基因組序列分析啟動(dòng)子，因其含有 TAGA 序列、CAAT 序列等啟動(dòng)子的核心序列，與病毒致瘤等密切相關(guān)（Felder et al., 1994），能夠起到調(diào)控作用。由于 ALV RNA 不是作為 mRNA 直接表達(dá)，但可以逆轉(zhuǎn)錄成前病毒 cDNA 整合到宿主細(xì)胞基因組中，病毒的功能組分隨著細(xì)胞 DNA 的復(fù)制、翻譯而被表達(dá)。ALV 前病毒基因組 cDNA 兩端具有長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR），其結(jié)構(gòu)相同，由 U3，R 以及 U三部分組成，主要負(fù)責(zé)病毒復(fù)制、翻譯、RNA 加工以及病毒整合于宿主基因組等（Chiu et al., 2000）。通常，內(nèi)源性病毒 LTR 的大小在 280bp 左右，外源性病毒 LTR的大小在 320bp左右，，但 K亞群病毒除外，其 LTR 大小與內(nèi)源性病毒相似。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 王鑫;趙鵬;崔治中;;我國(guó)地方品種雞分離到的一個(gè)禽白血病病毒新亞群的鑒定[J];病毒學(xué)報(bào);2012年06期

2 陳瑞愛(ài);;雞白血病生物防控措施要點(diǎn)[J];中國(guó)家禽;2010年07期

3 趙冬敏;張青嬋;崔治中;;蘆花雞中B亞群禽白血病病毒的分離與鑒定[J];病毒學(xué)報(bào);2010年01期

4 柴家前;王貴強(qiáng);孫淑紅;郭慧君;崔治中;;J亞群禽白血病病毒分子流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];山東畜牧獸醫(yī);2009年01期

本文編號(hào)：2661577