【摘要】：牦牛生活在青藏高原及其毗鄰的高海拔地區(qū),有“高原之舟”的美譽(yù),是當(dāng)?shù)鼐用窠?jīng)濟(jì)收入的主要來源之一,但其繁殖力較低,大部分為兩年一胎或三年兩胎。上世紀(jì)60年代以來,國內(nèi)外學(xué)者對(duì)牦牛生殖生理與繁殖技術(shù)展開了大量的研究,發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞的發(fā)育與減數(shù)分裂成熟是影響哺乳動(dòng)物繁殖效率的重要因素之一。減數(shù)分裂是真核生物有性生殖的共同特征,其進(jìn)程受多種因素的共同調(diào)控。表觀遺傳修飾可以確保與減數(shù)分裂有關(guān)的基因適當(dāng)表達(dá),促使與減數(shù)分裂進(jìn)程相關(guān)的染色體發(fā)育完整。最近的研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去甲基化酶參與了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控,KDM2(lysine(K)-specific demethylase 2)作為組蛋白去甲基化酶家族的成員之一,被發(fā)現(xiàn)在在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中有表達(dá),但有關(guān)KDM2在此過程中的功能未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過PCR克隆獲得牦牛組蛋白去甲基化酶KDM2A和KDM2B基因序列,進(jìn)行生物信息學(xué)分析;通過免疫組化和q PCR檢測KDM2在卵母細(xì)胞中的表達(dá)情況,然后通過KDM2的特異性抑制劑丁酰肼初步研究KDM2與牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的關(guān)系,并探討其作用。結(jié)果如下:1、測序結(jié)果顯示,KDM2A基因CDS區(qū)長為3 489 bp,編碼1 162個(gè)氨基酸;KDM2B基因CDS區(qū)長為3 930 bp,編碼1 309個(gè)氨基酸。同源性比對(duì)結(jié)果顯示KDM2在進(jìn)化過程中保守性較強(qiáng)。組織表達(dá)譜分析結(jié)果顯示KDM2在脾臟、子宮、睪丸和卵巢中表達(dá)量較高。2、免疫組化定位分析發(fā)現(xiàn)KDM2存在于牦牛卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中;q PCR定量分析發(fā)現(xiàn)KDM2在牦牛卵母細(xì)胞GV期、MI期和MII期中動(dòng)態(tài)變化,MI期的表達(dá)量顯著高于GV期和MII期。3、在體外成熟液中添加KDM2的特異性抑制劑丁酰肼,qPCR和免疫熒光結(jié)果顯示MI期卵母細(xì)胞中KDM2的表達(dá)量下降;當(dāng)丁酰肼濃度為20μmol/L時(shí),卵母細(xì)胞成熟率顯著降低,但受精后卵裂率和囊胚率顯著升高。本研究通過克隆獲得牦牛KDM2A和KDM2B基因序列,并發(fā)現(xiàn)KDM2在生殖器官中高表達(dá),同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的過程動(dòng)態(tài)表達(dá),添加20μmol/L特異性抑制劑丁酰肼后,能提高牦牛胚胎的卵裂率和囊胚率,但卵母細(xì)胞的成熟率下降了,其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本文為研究牦牛KDM2基因功能及其在生理生殖過程中所發(fā)揮的作用提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

PB）和1n2C的DNA補(bǔ)體。精子（1n1C）的進(jìn)入導(dǎo)致第二極體的排出并使卵母細(xì)胞形成1n1C狀態(tài)，在受精后的第一次有絲分裂后形成二倍體胚胎（2n2C）。隨后的所有分裂都是有絲分裂，產(chǎn)生兩個(gè)相同的子細(xì)胞（圖1.1）。體內(nèi)，恢復(fù)減數(shù)分裂的誘因是排卵前的促黃體素（luteinizing hormone，LH）峰。卵泡中存在允許自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂的抑制性影響(Pincus et al., 1935)，因此，脫離卵泡進(jìn)行體外培養(yǎng)這一方法已被大規(guī)模用于體外生產(chǎn)牛胚胎。與上述的核成熟相同的是，卵母細(xì)胞還要經(jīng)歷細(xì)胞質(zhì)的成熟，涉及包括皮質(zhì)顆粒在內(nèi)的各種細(xì)胞器的重新分布，為受精作準(zhǔn)備(Hytteletal., 1989; Hyttel et al., 1986)。圖 1.1 卵母細(xì)胞成熟過程Figure 1.1 The process of oocyte maturation1.1.1 體內(nèi)成熟哺乳動(dòng)物的發(fā)情周期由兩三波卵泡生長構(gòu)成，伴隨著促卵泡素（follicle-stimulating Hormone，F(xiàn)SH）的短暫升高

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有 4 個(gè)成員 KDM4A/JHDM3A/JMJD2A，KDM4B/JHDM3B/JMJD2B ， KDM4C/ JHDM3C/JMJD2C/GASC1 和 KDM4D/JHDM3D/JMJD2D。KDM4 蛋白催化 H3K9me3/me2 和 H3K36me3/me2 的去甲基化，其底物特異性在家族成員之間不同(Fodor et al., 2006; Klose et al., 2006)。此外，KDM4 蛋白還被證明是 H1.4K26me3/me2 的去甲基化酶(Trojer et al., 2009)。KDM5 蛋白催化H3K4me3/me2 的去甲基化。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，KDM5 家族由 KDM5A /JARID1A/RBP2，KDM5B/JARID1B/PLU-1，，KDM5C/JARID1C/SMCX X 和 KDM5D/JARID1D/SMCY 組成。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的 KDM6 亞家族由 KDM6A/UTX ， UTY 和KDM6B/JMJD3 組成。KDM6A 和 KDM6B 在 H3K27me3/me2 上的催化活性高于 UTY。哺乳動(dòng)物 PHF8 具有 H3K9me2/me1 活性(Horton et al., 2010; Kleine-Kohlbrecher et al.,2010)，而 JHDM1D / KIAA1718 靶向 H3K9me2/me1 和 H3K27me2/me1(Tsukada et al.,2010; Huang et al., 2010)。
【學(xué)位授予單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823.85

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本文編號(hào)：2661305