【摘要】：圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝病是一種重要的奶牛營養(yǎng)代謝性疾病,它常發(fā)于圍產(chǎn)期的高產(chǎn)奶牛,其發(fā)病原因是圍產(chǎn)期的奶牛采食量下降,泌乳需求上升,泌乳高峰早于采食高峰導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生能量負(fù)平衡,使脂肪動員產(chǎn)生能量來供給機(jī)體泌乳需要,而脂肪動員生成的大量非酯化脂肪酸(NEFAs)運(yùn)輸?shù)礁闻K,在肝臟合成了大量的甘油三酯(TG),遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了肝臟能夠以極低密度脂蛋白(VLDL)形式輸出的量,從而導(dǎo)致了大量TG在肝臟蓄積。圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝病降低了奶牛的采食量與產(chǎn)奶量,損害了奶牛的繁殖能力和免疫功能,降低了牛奶的質(zhì)量,提高了奶�；几鞣N產(chǎn)后疾病的風(fēng)險(xiǎn)及奶牛的淘汰率,每年都會給養(yǎng)牛業(yè)造成一筆巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為探究NEFAs對奶牛脂肪酸從頭合成調(diào)控因子的影響,在奶牛脂肪肝病發(fā)展中的作用,以及探究Ca~(2+)相關(guān)的NF-κB-Orai1信號通路是否在NEFAs介導(dǎo)的奶牛脂肪酸從頭合成調(diào)節(jié)過程中有所參與,本研究通過體外培養(yǎng)犢牛原代肝細(xì)胞,添加NEFAs刺激細(xì)胞,并加入NF-κB抑制劑Wogonin與Orai1抑制劑2-APB,通過檢測細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的變化,脂肪酸從頭合成相關(guān)調(diào)控因子SREBP-1c、ACC1和FAS的表達(dá)調(diào)控,以及觀測細(xì)胞脂滴生成情況,來綜合評價(jià)NEFAs在奶牛脂肪肝病發(fā)生發(fā)展中的影響,并通過細(xì)胞沉默實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了Orai1信號通路在奶牛脂肪酸從頭合成過程中的參與作用。胞內(nèi)Ca~(2+)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,隨著NEFAs刺激時(shí)間的延長,胞內(nèi)Ca~(2+)濃度在不斷升高,刺激3 h與刺激12 h時(shí)的胞內(nèi)Ca~(2+)與0 h相比差異顯著(p0.05),刺激6 h與刺激9 h時(shí)胞內(nèi)Ca~(2+)與0 h相比差異極顯著(p0.01)。QRT-PCR檢測犢牛原代肝細(xì)胞不同處理下NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Fas、Acc1的mRNA表達(dá)水平的結(jié)果顯示,NEFA組的NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Fas、Acc1的mRNA表達(dá)水平均極顯著高于control組(p0.01);經(jīng)2-APB試劑預(yù)處理的NEFA組的NF-κB p65、Srebp-1c的mRNA表達(dá)水平均顯著低于NEFA組(p0.05),Orai1、Fas、Acc1的mRNA表達(dá)水平均極顯著低于NEFA組(p0.01);經(jīng)Wogonin試劑預(yù)處理的NEFA組的Fas的mRNA表達(dá)水平顯著低于NEFA組(p0.05),NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Acc1的mRNA表達(dá)水平均極顯著低于NEFA組(p0.01)。Western Blot方法檢測犢牛原代肝細(xì)胞不同處理下NF-κB p65、ORAI1、SREBP-1、FAS、ACC1的蛋白表達(dá)水平的結(jié)果顯示,NEFA組的ORAI1、ACC1的蛋白表達(dá)水平均顯著高于control組(p0.05),NF-κB p65、SREBP-1、FAS的蛋白表達(dá)水平均極顯著高于control組(p0.01);經(jīng)2-APB試劑預(yù)處理的NEFA組的ORAI1、SREBP-1的蛋白表達(dá)水平均顯著低于NEFA組(p0.05),NF-κB p65、FAS、ACC1的蛋白表達(dá)水平均極顯著低于NEFA組(p0.01);經(jīng)Wogonin試劑預(yù)處理的NEFA組的FAS、ACC1的蛋白表達(dá)水平均顯著低于NEFA組(p0.05),NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平極顯著低于NEFA組(p0.01)。激光共聚焦熒光檢測犢牛原代肝細(xì)胞脂滴生成情況結(jié)果顯示,犢牛原代肝細(xì)胞不同處理下NF-κB p65、Orai1、SREBP-1c、FAS、ACC1的脂滴生成水平有所差異,NEFA組的脂滴生成水平極顯著高于control組(p0.01);經(jīng)2-APB、Wogonin試劑預(yù)處理的NEFA組的脂滴生成水平均顯著低于NEFA組(p0.05)。沉默Orai1基因可見Orai1、SREBP-1c、FAS、ACC1的mRNA與蛋白表達(dá)水平都有了顯著下調(diào)(p0.05)。NF-κB能夠調(diào)控奶牛體內(nèi)Orai1信號通路,刺激細(xì)胞Ca~(2+)內(nèi)流,參與調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸從頭合成調(diào)控因子表達(dá)水平上調(diào),使肝脂合成增多,從而提高了圍產(chǎn)期奶�；贾靖尾〉娘L(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)對于圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝的發(fā)生機(jī)制研究、預(yù)防和診治具有重要的意義,對Orai1通路的研究或可開啟圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝病藥物治療研發(fā)的新道路。
【圖文】：

結(jié)果與分析結(jié)果與分析 犢牛原代肝細(xì)胞發(fā)生肝脂沉積時(shí)細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的差異變化為探究高濃度 NEFAs 對圍產(chǎn)期奶牛細(xì)胞內(nèi)外 Ca2+交換的影響，我們利用犢牛原加高濃度 NEFAs 模擬圍產(chǎn)期奶牛肝臟環(huán)境，檢測犢牛原代肝細(xì)胞在不同刺激時(shí)a2+濃度的變化并分析。結(jié)果如圖 3-1 所示，，隨著 NEFAs 刺激時(shí)間的延長，胞內(nèi)在不斷升高，刺激 3 h 與刺激 12 h 時(shí)的胞內(nèi) Ca2+與 0 h 相比胞內(nèi) Ca2+濃度顯著<0.05），刺激 6 h 與刺激 9 h 時(shí)胞內(nèi) Ca2+濃度與 0 h 相比差異極顯著上升（p<0.0

NEFAs 激活 NF-κB-Orai1 信號通路介導(dǎo)犢牛肝細(xì)胞脂肪酸從頭合成的調(diào)控機(jī)制沉默 Orai1 信號通路后犢牛原代肝細(xì)胞脂肪酸從頭合成調(diào)控白表達(dá)水平的差異變化為探究 Orai1 是否參與調(diào)控圍產(chǎn)期奶牛脂肪酸從頭合成，我們沉默了rai1 基因，通過檢測犢牛原代肝細(xì)胞脂肪酸從頭合成相關(guān)調(diào)控因子的1 信號通路是否參與了圍產(chǎn)期奶牛脂肪酸從頭合成過程中。圖 3-2、圖肝細(xì)胞沉默了 Orai1 基因之后，脂肪酸從頭合成相關(guān)調(diào)控因子 SREBP-RNA 與蛋白表達(dá)水平結(jié)果。由圖 3-2、圖 3-3 可見，siOrai1 組的 Ora、ACC1 的 mRNA 與蛋白的表達(dá)水平與 siN 組相比都有顯著的下調(diào)（
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

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本文編號：2661150