【摘要】：東方泰勒蟲(Theileria Oriental)是一種經(jīng)蜱傳播的胞內(nèi)原生動(dòng)物寄生蟲,在世界范圍內(nèi)廣泛分布。該病原體能夠引發(fā)牛東方泰勒蟲病,其主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、溶血性貧血、生產(chǎn)力下降、乳牛和肉牛的流產(chǎn)或死亡,給養(yǎng)牛業(yè)造成了經(jīng)濟(jì)損失和危害。目前,血液直接PCR檢測方法因其不需要提取DNA而直接應(yīng)用血液,從而節(jié)約時(shí)間減少成本故逐漸發(fā)展并應(yīng)用于動(dòng)物疾病流行病學(xué)研究。因此本試驗(yàn)直接以患東方泰勒蟲病的牛血液為模板,建立了血液直接PCR檢測方法。本文首先根據(jù)Genbank上發(fā)布的東方泰勒蟲p33基因序列[DQ078264.1]設(shè)計(jì)一對特異性引物,并以血液為模版,采用血液直接PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增出一條416 bp大小的條帶,通過測序得到的核酸序列與基因文庫中發(fā)表的p33基因進(jìn)行序列比對同源性高達(dá)99%,進(jìn)而確定該目的片段為p33基因。此外,本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物均未能對弓形蟲、新孢子蟲、牛附紅細(xì)胞體擴(kuò)增出目的條帶,說明該方法具有良好的特異性。同時(shí),該方法能檢測出1μL血液最大稀釋倍數(shù)為40倍。說明該方法具有良好的敏感性。另外,分別對5份同一批的東方泰勒蟲陽性血液樣品進(jìn)行血液直接PCR檢測以及常規(guī)PCR檢測并重復(fù)3次試驗(yàn)結(jié)果一致說明該方法重復(fù)性良好。采集吉林省多個(gè)縣市共210份疑似牛東方泰勒蟲抗凝血進(jìn)行血液直接PCR檢測,與常規(guī)PCR法進(jìn)行比較,確定該方法在診斷檢測方面的優(yōu)勢。結(jié)果顯示,直接PCR總陽性率為30.0%,而常規(guī)PCR總陽性率為25.7%,兩種方法的符合率為94.0%,一致性分析Kappa值為0.85。陽性符合率為80.0%,陰性符合率為92.0%;通化地區(qū)陽性率最高,為75.0%,而洮南地區(qū)陽性率最低,為12.0%,不同地區(qū)陽性率之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。該檢測結(jié)果與胡詩悅等報(bào)道的吉林省的牛東方泰勒蟲感染率為21.1%～75.9%結(jié)果相符。結(jié)果表明該方法更值得推廣和應(yīng)用。本試驗(yàn)建立一種簡便、快捷、敏感、特異的東方泰勒蟲快速檢測方法,可適用于東方泰勒蟲病的診斷和流行病調(diào)查。
【圖文】：

１邋ＰＣＲ擴(kuò)增逡逑以ＰＩ、Ｐ２為引物，東方泰勒蟲陽性血液為模板，進(jìn)行血液直接ＰＣＲ擴(kuò)增和逡逑常規(guī)ＰＣＲ，得到大小約為４１６ｂｐ的ＤＮＡ片段，與預(yù)期目的片段大小一致，如圖１。逡逑Ｍ邋１邐２邐３逡逑２０００ｂｐ——＞邋Ｉ逡逑７５０ｂｐ邋邐＞逡逑５００ｂｐ邐＞邐＜——４１６ｂｐ逡逑２５０ｂｐ——＞邋Ｉ邋．邋ｃ邋：》、逡逑圖１東方泰勒蟲直接ＰＣＲ擴(kuò)增和常規(guī)ＰＣＲ逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｄｉｒｅｃｔ邋ＰＣＲ邋ａｎｄ邋Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ邋Ｏｒｉｅｎｔａｌ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；１：常規(guī)ＰＣＲ結(jié)果；２：血液直接ＰＣＲ結(jié)果；３：水逡逑對照逡逑Ｍ：ＤＬ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；ｌ：邋Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ邋ＰＣＲ；２：邋Ｄｉｒｅｃｔ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ＾：逡逑Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋（ｄｄＫｈＯ）逡逑２目的基因的測序及序列分析逡逑將鑒定合格的血液直接ＰＣＲ樣品送至上海英駿公司測序后顯示，所克隆的逡逑融合基因長為４１６邋ｂｐ，此基因與ＧｅｎＢａｎｋ上登錄的東方泰勒蟲ｐ３３基因序逡逑（ＤＱ０７８２６４．１）的同源性為９９％，如圖２。逡逑１４逡逑

脂糖凝膠電泳檢測，在４１６邋ｂｐ處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期口的片段大小相同。結(jié)逡逑果出現(xiàn)的特異條帶在５１．９°Ｃ時(shí)條帶最亮，故選擇５１．９°Ｃ為eA伴退火溫度結(jié)果，如逡逑圖３。逡逑Ｍ１２邐３４邐５６７８逡逑２０００ｂｐ邐＞逡逑７５０ｂｐ邋邐＞逡逑４ｉ６ｂｐ逡逑Ｉ＾＾ＨＩ逡逑圖３直接ＰＣＲ退火溫度篩選結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．３邋Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋Ｄｉｒｅｃｔ邋ＰＣＲ邋ａｎｎｅａｌｉｎｇ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ逡逑Ｍ：ＤＮＡ邋分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；１邋？８．退火溫度：５０邋Ｃ、５０．邋７’Ｃ、５１．邋９邋Ｃ、５３．邋７邋Ｃ、５６．邋１Ｃ、逡逑５８＾Ｃ邋＞邋５９．邋２°Ｃ邋ｘ邋６０邋Ｃ邋；逡逑Ｍ邋：邋１）１，２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１邋？８．邋ａｎｎｅａｌｉｎｇ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：５０＂Ｃ、５０．７°Ｃ、５邋１邋．ＶＣ、５３．７°Ｃ、逡逑５６．１°Ｃ
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2660109