【摘要】：豬呼吸道疾病是制約世界各地集約化養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展的重要疾病之一。其中豬肺炎支原體是引起各國養(yǎng)殖業(yè)中豬的地方流行性呼吸道疾病氣喘病的主要病原,氣喘病作為一種發(fā)病率高和致死率低的慢性呼吸道疾病,主要引起豬慢性干咳、生長緩慢和對飼料利用率降低。自上個世紀三十年代該病首次被德國科學(xué)家報道以來,豬氣喘病已經(jīng)給世界各地養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。在實際生產(chǎn)中,感染豬肺炎支原體的豬更容易繼發(fā)感染細菌性病原,從而給養(yǎng)豬業(yè)造成更大的經(jīng)濟損失。豬鏈球菌2型是一種危害極大的人獸共患病病原體,能夠感染人和豬,引起肺炎和腦膜炎。在當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)中,豬鏈球菌2型經(jīng)常繼發(fā)感染患有支原體肺炎的保育豬肺組織,在豬鏈球菌2型與豬肺炎支原體的混合感染下,使保育豬的呼吸道疾病變得復(fù)雜多變,莢膜多糖在豬鏈球菌2型的致病過程中扮演重要角色,其中莢膜多糖的合成需要多個基因共同參與。本研究針對豬的復(fù)雜呼吸道疾病等科學(xué)問題,開展了對豬肺炎支原體的分離和培養(yǎng)工作;通過第三代測序技術(shù)完成了對新分離株的全基因組測序和組裝,通過比較基因組學(xué)挖掘了其特有致病相關(guān)因子及致病性豬肺炎支原體的共有基因;通過動物實驗評估了新分離野生株作為疫苗對豬的免疫保護效果。針對被預(yù)測參與莢膜多糖重復(fù)糖單元合成的4個基因(cps2E、cps2G、cps2J和cps2L),通過基因缺失及生物學(xué)特性研究,確定了其在豬鏈球菌2型莢膜多糖合成中的作用。主要研究結(jié)果如下:1.豬肺炎支原體ES-2株的分離培養(yǎng)及致病性研究本研究采用了一種多點取樣連續(xù)傳代的方法,并通過使用Friis培養(yǎng)基成功從湖北恩施黑豬肺組織中分離出豬肺炎支原體,并將其命名為豬肺炎支原體ES-2株。ES-2株在改良Friis培養(yǎng)基中培養(yǎng)至48h左右,其生長滴度最高可達到1×10~(10)CCU/mL,在固體平板上呈“煎蛋樣”形態(tài)。ES-2細胞呈圓形或卵圓形,其直徑在0.2-1.6μm之間,對卡那霉素(MIC=2μg/mL)最敏感。動物實驗結(jié)果顯示,豬肺炎支原體ES-2株對宿主具有高致病性,引起豬肺部出現(xiàn)典型的支原體肺炎“肉變”,支氣管上皮細胞的纖毛分叉、變短甚至脫落等病變。在通過氣管感染不同劑量豬肺炎支原體ES-2株(7×10~6 CCU、7×10~7 CCU、7×10~8 CCU和7×10~9 CCU)的感染組中,其中攻毒劑量為7×10~7 CCU的感染組發(fā)病率最高且病變最嚴重。2.豬肺炎支原體ES-2株的全基因組特征及比較基因組學(xué)分析本研究通過第三代測序PacBio方法完成對ES-2株全基因組的測序與組裝,通過起始位點校正繪制了ES-2株基因組完成圖,利用生物信息學(xué)工具預(yù)測基因組的ORFs,并進一步利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫NCBI NR和UNIPORT對ORFs進行注釋,利用COG數(shù)據(jù)庫對注釋的蛋白進行分類,通過與VFDB數(shù)據(jù)庫比對挖掘其毒力因子。通過將ES-2株全基因組與從NCBI收集的161株分離自不同宿主的支原體全基因組做進化樹分析,親緣關(guān)系顯示ES-2株與已報道的另外8株豬肺炎支原體、1株豬絮狀支原體和2株牛差異霉形體位于同一個分支,同豬鼻支原體的親緣關(guān)系較近,與人肺炎支原體的親緣關(guān)系最遠。為了挖掘出致病性豬肺炎支原體的共有基因,本研究利用BlASTP比較了致病性(ES-2、168、7422和7448)和非致病性(J)豬肺炎支原體的全基因組,通過設(shè)置不同的相似度(0.75、0.80、0.85、0.90、0.95和0.99),初步篩選出34個致病性豬肺炎支原體的共有基因。通過進一步比對分析,最終在氨基酸和核苷酸水平上,只鑒別出一個致病性豬肺炎支原體的共有基因(ES-2_00484)。3.豬肺炎支原體ES-2株對豬的免疫保護效果研究本研究基于豬肺炎支原體ES-2株具有生長滴度高且生長速度快的優(yōu)點,將其制備成豬肺炎支原體ES-2株滅活疫苗,通過給仔豬免疫接種不同劑量的豬肺炎支原體ES-2株滅活疫苗來評估該滅活疫苗的最佳免疫保護劑量。免疫保護結(jié)果顯示1.6×10~9 CCU/頭份的ES-2株免疫劑量對豬的免疫保護效果最佳,1.6×10~7CCU/頭份和1.6×10~8 CCU/頭份的ES-2株免疫劑量能達到與商業(yè)豬肺炎支原體滅活疫苗(1.6×10~8 CCU/頭份)對豬同等的免疫保護效果。4.豬鏈球2型菌莢膜多糖合成相關(guān)基因的研究本研究通過同源重組方法成功將4個基因(cps2E、cps2G、cps2J和cps2L)分別從豬鏈球菌2型中缺失,構(gòu)建了4個莢膜多糖單基因缺失株(Δcps2E、Δcps2G、Δcps2J和Δcps2L)。實驗結(jié)果顯示,由于基因cps2E、cps2G、cps2J或cps2L的缺失,導(dǎo)致豬鏈球菌2型表面的莢膜多糖嚴重缺失,而且莢膜多糖中的唾液酸含量顯著下降。體外和體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,莢膜多糖缺失突變株Δcps2E、Δcps2G、Δcps2J或Δcps2L與宿主的相互作用發(fā)生明顯變化,對小鼠動物模型的致病能力顯著下降�？傊�,本研究證實了基因cps2E、cps2G、cps2J和cps2L參與了豬鏈球菌2型細胞表面莢膜多糖的合成,并且進一步的研究表明這些基因在豬鏈球菌2型對宿主的入侵及定殖過程中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

肺炎支原體細胞呈圓形或橢圓形，其直徑介于 0.5-0.8 μm 之間（圖 1-1）異性感染豬，是引起豬呼吸道疾病的重要病原之一（Tajima et al 1nchard et al 1992）。而且臨床分離的不同豬肺炎支原體野生株在致病能呈現(xiàn)出多樣性（Vicca et al 2003, Villarreal et al 2009）。

需在多種表面蛋白（P97、P102、P116、P135、P159 和 P216）和宿主細胞相互作用下完成（圖1-2）。隨后豬肺炎支原體導(dǎo)致被黏附的纖毛生長停滯、聚集成簇直至脫落，嚴重的則可導(dǎo)致纖毛上皮細胞脫落（Jericho et al 1986）（圖 1-3）。目前關(guān)于豬肺炎支原體引起纖毛損傷的機制很少，有研究報道致病性豬肺炎支原體跟纖毛的黏附刺激了氣管細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放，并認為鈣離子調(diào)控的信號通路與上皮細胞纖毛的脫落有關(guān)（Seung-Chun et al 2002）。纖毛活性的損壞或缺失一旦出現(xiàn)，，就會導(dǎo)致呼吸道第一道防御屏障黏膜系統(tǒng)清除能力的減弱，使得豬肺炎支原體在呼吸道內(nèi)進一步增殖從而引起更嚴重的感染。圖 1-2 豬肺炎支原體感染宿主的模式圖（Tao et al 2019）Fig 1-2 A schematic representation of infection by M. hyopneumoniae
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.6

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2660066