【摘要】：目前,酮病與脂肪肝已成為我國集約化牧場高產(chǎn)奶牛圍產(chǎn)期常見的且多發(fā)的主要營養(yǎng)代謝病之一。因它造成奶牛泌乳量下降,誘發(fā)奶牛發(fā)生真胃變位,胎衣不下或生產(chǎn)癱瘓等其他疾病。給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而,奶牛脂肪肝的診斷技術(shù)依然停留在通過活體奶牛肝臟穿刺來檢測肝脂浸潤程度,并且臨床上奶�；铙w肝穿刺因保定困難、損傷肝臟、檢測費用高等原因,難以被養(yǎng)殖場接受。迄今為止,國內(nèi)外缺乏一種快速、實用且準(zhǔn)確監(jiān)測奶牛脂肪肝的方法。鑒于國外已開發(fā)和應(yīng)用對氧磷酸酶-1(PON-1)酶聯(lián)免疫(ELISA)方法監(jiān)測奶牛脂肪肝和酮病,但價格昂貴,而國內(nèi)缺發(fā)自主研發(fā)的類似產(chǎn)品。為此,本研究研制牛PON-1單克隆抗體,以此為基礎(chǔ)建立PON-1雙抗夾心ELISA檢測方法,并實施臨床應(yīng)用試驗,為今后國內(nèi)奶牛酮病和脂肪肝的快速監(jiān)測提供新的技術(shù)。本研究運用原核表達(dá)技術(shù)將優(yōu)化的牛屬PON-1蛋白基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒PET28a-PON-1。將PET28a-PON-1轉(zhuǎn)化表達(dá)的菌株擴(kuò)增培養(yǎng),在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá),經(jīng)純化得到約37KD的重組牛PON-1蛋白。而后,用重組牛PON-1蛋白免疫Balb/c小鼠獲得一株穩(wěn)定分泌特異性抗體且效價高的雜交瘤細(xì)胞株4K2D。并將4K2D注入經(jīng)產(chǎn)的Balb/c小鼠腹腔,收集的腹水經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化,獲得牛PON-1單克隆抗體。另外,以重組牛PON-1蛋白為抗原免疫家兔,血清經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化,獲得牛PON-1蛋白的多克隆抗體。最后利用純化的單抗為檢測抗體,純化的多抗為捕獲抗體,辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為酶標(biāo)二抗,成功構(gòu)建牛PON-1蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法。本研究將自主創(chuàng)建的牛PON-1雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行臨床試驗。隨機(jī)采集產(chǎn)犢后14-21天的奶牛血清62頭份,用生化分析儀檢測血清中BHBA、GLU、AST、NEFA的水平,根據(jù)BHBA含量將其分為酮病組和健康對照組,用所研發(fā)的牛PON-1雙抗夾心ELISA方法檢測試驗?zāi)膛Ｑ錚ON-1的含量。結(jié)果顯示:酮病組與對照組比較,血清PON-1含量顯著的下降(P0.05),與商用牛PON-1酶聯(lián)免疫試劑盒的結(jié)果比較無顯著差異。并且,依據(jù)顯著性分析、相關(guān)性分析和二元回歸及受試者工作特征曲線(ROC)分析,確定牛血清PON-1可作為奶牛酮病發(fā)生的風(fēng)險預(yù)警指標(biāo),其預(yù)警值為62.37nmol/L。結(jié)論:本研究自主創(chuàng)建了牛PON-1雙抗夾心ELISA方法,確立基于PON-1的奶牛酮病和風(fēng)險預(yù)警指標(biāo)及其預(yù)警值,為今后監(jiān)測奶牛酮病和脂肪肝提供新的技術(shù)。
【圖文】：

Figure 2.1.1 pET-28a plasmid sequence矩形框中為雙酶切位點2.1.2.2 優(yōu)化基因序列根據(jù) GENBANK 中查詢的牛 PON-1 的基因序列（XP616349）并利用大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化（http//www.jcat.de/start.jsp，host organism: E.coil strain K12），最終得到優(yōu)化后基因序列。2.1.2.3 目的基因合成根據(jù)優(yōu)化后基因序列進(jìn)行目的基因合成，本部分實驗交由金唯智生物科技有限公司完成，公司合成的目的基因附加在 pUC57 載體質(zhì)粒中。2.1.2.4 提取質(zhì)粒從液氮中取出 E.Coli DH5ɑ宿主菌（含 pET-28a 質(zhì)粒）和公司提供的宿主菌（含 pUC57質(zhì)粒），分別添加 50μL 凍存菌液在 5mL 的 LB 培養(yǎng)基中（預(yù)加 Amp），37℃孵育過夜。根據(jù) AXYGEN 公司的質(zhì)粒提取試劑盒說明書，按照操作步驟提取質(zhì)粒。質(zhì)

圖 2.1.4 合成基因和菌液基因測序的對比結(jié)果Figure 2.1.4 Contrast results for synthetic and sequencing g2.1.3.5 蛋白誘導(dǎo)表達(dá) SDS-PAGE 電泳檢測保種的陽性表達(dá)菌經(jīng)公司測序，確定目的片段成功進(jìn)入表達(dá)菌體后，擴(kuò)在一定時間后加入 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。大量表達(dá)后收菌，經(jīng) SDS-PAGE 凝膠表達(dá)了 37KD 大小的目的蛋白（圖 2.1.5a）。表達(dá)的蛋白經(jīng)超聲離心，分涵體中蛋白表達(dá)，37KD 目的蛋白在包涵體中表達(dá)（圖 2.1.5b）
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2659397