【摘要】：目前,酮病與脂肪肝已成為我國(guó)集約化牧場(chǎng)高產(chǎn)奶牛圍產(chǎn)期常見的且多發(fā)的主要營(yíng)養(yǎng)代謝病之一。因它造成奶牛泌乳量下降,誘發(fā)奶牛發(fā)生真胃變位,胎衣不下或生產(chǎn)癱瘓等其他疾病。給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而,奶牛脂肪肝的診斷技術(shù)依然停留在通過活體奶牛肝臟穿刺來檢測(cè)肝脂浸潤(rùn)程度,并且臨床上奶牛活體肝穿刺因保定困難、損傷肝臟、檢測(cè)費(fèi)用高等原因,難以被養(yǎng)殖場(chǎng)接受。迄今為止,國(guó)內(nèi)外缺乏一種快速、實(shí)用且準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)奶牛脂肪肝的方法。鑒于國(guó)外已開發(fā)和應(yīng)用對(duì)氧磷酸酶-1(PON-1)酶聯(lián)免疫(ELISA)方法監(jiān)測(cè)奶牛脂肪肝和酮病,但價(jià)格昂貴,而國(guó)內(nèi)缺發(fā)自主研發(fā)的類似產(chǎn)品。為此,本研究研制牛PON-1單克隆抗體,以此為基礎(chǔ)建立PON-1雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法,并實(shí)施臨床應(yīng)用試驗(yàn),為今后國(guó)內(nèi)奶牛酮病和脂肪肝的快速監(jiān)測(cè)提供新的技術(shù)。本研究運(yùn)用原核表達(dá)技術(shù)將優(yōu)化的牛屬PON-1蛋白基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒PET28a-PON-1。將PET28a-PON-1轉(zhuǎn)化表達(dá)的菌株擴(kuò)增培養(yǎng),在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá),經(jīng)純化得到約37KD的重組牛PON-1蛋白。而后,用重組牛PON-1蛋白免疫Balb/c小鼠獲得一株穩(wěn)定分泌特異性抗體且效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞株4K2D。并將4K2D注入經(jīng)產(chǎn)的Balb/c小鼠腹腔,收集的腹水經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化,獲得牛PON-1單克隆抗體。另外,以重組牛PON-1蛋白為抗原免疫家兔,血清經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化,獲得牛PON-1蛋白的多克隆抗體。最后利用純化的單抗為檢測(cè)抗體,純化的多抗為捕獲抗體,辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為酶標(biāo)二抗,成功構(gòu)建牛PON-1蛋白雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法。本研究將自主創(chuàng)建的牛PON-1雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行臨床試驗(yàn)。隨機(jī)采集產(chǎn)犢后14-21天的奶牛血清62頭份,用生化分析儀檢測(cè)血清中BHBA、GLU、AST、NEFA的水平,根據(jù)BHBA含量將其分為酮病組和健康對(duì)照組,用所研發(fā)的牛PON-1雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ錚ON-1的含量。結(jié)果顯示:酮病組與對(duì)照組比較,血清PON-1含量顯著的下降(P0.05),與商用牛PON-1酶聯(lián)免疫試劑盒的結(jié)果比較無顯著差異。并且,依據(jù)顯著性分析、相關(guān)性分析和二元回歸及受試者工作特征曲線(ROC)分析,確定牛血清PON-1可作為奶牛酮病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警指標(biāo),其預(yù)警值為62.37nmol/L。結(jié)論:本研究自主創(chuàng)建了牛PON-1雙抗夾心ELISA方法,確立基于PON-1的奶牛酮病和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警指標(biāo)及其預(yù)警值,為今后監(jiān)測(cè)奶牛酮病和脂肪肝提供新的技術(shù)。
【圖文】：

Figure 2.1.1 pET-28a plasmid sequence矩形框中為雙酶切位點(diǎn)2.1.2.2 優(yōu)化基因序列根據(jù) GENBANK 中查詢的牛 PON-1 的基因序列（XP616349）并利用大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化（http//www.jcat.de/start.jsp，host organism: E.coil strain K12），最終得到優(yōu)化后基因序列。2.1.2.3 目的基因合成根據(jù)優(yōu)化后基因序列進(jìn)行目的基因合成，本部分實(shí)驗(yàn)交由金唯智生物科技有限公司完成，公司合成的目的基因附加在 pUC57 載體質(zhì)粒中。2.1.2.4 提取質(zhì)粒從液氮中取出 E.Coli DH5ɑ宿主菌（含 pET-28a 質(zhì)粒）和公司提供的宿主菌（含 pUC57質(zhì)粒），分別添加 50μL 凍存菌液在 5mL 的 LB 培養(yǎng)基中（預(yù)加 Amp），37℃孵育過夜。根據(jù) AXYGEN 公司的質(zhì)粒提取試劑盒說明書，按照操作步驟提取質(zhì)粒。質(zhì)

圖 2.1.4 合成基因和菌液基因測(cè)序的對(duì)比結(jié)果Figure 2.1.4 Contrast results for synthetic and sequencing g2.1.3.5 蛋白誘導(dǎo)表達(dá) SDS-PAGE 電泳檢測(cè)保種的陽性表達(dá)菌經(jīng)公司測(cè)序，確定目的片段成功進(jìn)入表達(dá)菌體后，擴(kuò)在一定時(shí)間后加入 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。大量表達(dá)后收菌，經(jīng) SDS-PAGE 凝膠表達(dá)了 37KD 大小的目的蛋白（圖 2.1.5a）。表達(dá)的蛋白經(jīng)超聲離心，分涵體中蛋白表達(dá)，37KD 目的蛋白在包涵體中表達(dá)（圖 2.1.5b）
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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1 張江;孫書函;趙暢;范子玲;白云龍;舒適;夏成;;黑龍江省某集約化牛場(chǎng)酮病奶牛血液生化指標(biāo)變化[J];畜牧與獸醫(yī);2018年01期

2 楊海軍;;實(shí)現(xiàn)乳制品的功能化[J];食品安全導(dǎo)刊;2017年31期

3 曹宇;張江;楊威;夏成;張洪友;王艷輝;徐闖;;血漿對(duì)氧磷酶1在奶牛酮病中的變化及其預(yù)測(cè)作用[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2016年11期

4 楊麗麗;阮秋蓉;;對(duì)氧磷酶3基因研究進(jìn)展[J];中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志;2012年10期

5 姬希文;閆麗萍;顏丕熙;李國(guó)新;張七斤;李澤君;;鴨坦布蘇病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年08期

6 谷立坤;張建云;;兔血清對(duì)氧磷酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)純化[J];中國(guó)釀造;2011年08期

7 孟琳;田景振;;動(dòng)物組織蛋白質(zhì)提純方法的研究進(jìn)展[J];食品與藥品;2009年05期

8 鄺愛麗;陳圓圓;彭志峰;鄭鹿平;付仁一;徐雪;郭倫濤;王川慶;;包涵體的形成原因及其處理方法[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;2009年01期

9 黃克和;;奶牛酮病和脂肪肝綜合癥研究進(jìn)展[J];中國(guó)乳業(yè);2008年06期

10 李園園;李萍;;對(duì)氧磷酶的生物學(xué)特性及與疾病的關(guān)系[J];現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2007年03期

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1 李玉;奶牛酮病氧化應(yīng)激致肝細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2014年

2 王建國(guó);圍產(chǎn)期健康奶牛與酮病、亞臨床低鈣血癥病牛血液代謝譜的比較與分析[D];吉林大學(xué);2013年

3 姬愛國(guó);牛8個(gè)基因的克隆、表達(dá)特征、原核表達(dá)、SNPs檢測(cè)及其與部分性狀的關(guān)聯(lián)分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

4 夏成;奶牛酮病、脂肪肝糖異生和脂肪動(dòng)員的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制[D];吉林大學(xué);2005年

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1 曹宇;對(duì)氧磷酶-1對(duì)奶牛酮病和綿羊脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警作用[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2017年

2 李超;甲基乙二醛在圍產(chǎn)期奶牛酮病群體監(jiān)測(cè)中的作用[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

3 張敏;能量負(fù)平衡奶牛肝脂沉積過程中SREBP-1c/Cidea通路的作用機(jī)制[D];吉林大學(xué);2016年

4 金雯;食品中鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）IC-ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2016年

5 高陽;奶牛酮病發(fā)病率調(diào)查及丙二醇預(yù)防酮病的效果研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2015年

6 曾妮;抗狂犬病病毒N蛋白單克隆抗體的制備及免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

7 張瑞華;亞臨床酮病對(duì)奶牛產(chǎn)奶和繁殖性能的影響及其血液生化指標(biāo)的變化[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

8 劉征;重組大腸桿菌高效分泌表達(dá)雜合β-1，3-1，，4-葡聚糖酶[D];廈門大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2659397