【摘要】：寄生旋毛形線蟲(Trichinella spiralis,T.spiralis),簡(jiǎn)稱旋毛蟲,是骨骼肌特有的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲,能夠感染多種哺乳動(dòng)物,包括人類,并廣泛引起人及其他動(dòng)物旋毛蟲病(Trichinellosis)。旋毛蟲通過其排泄分泌(Excretion-secretory,ES)產(chǎn)物對(duì)宿主免疫反應(yīng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。旋毛蟲及其產(chǎn)物通過抑制宿主免疫反應(yīng),從而有利于其在宿主體內(nèi)的生存。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell,DCs)被歸類為高度有效的專業(yè)抗原遞呈細(xì)胞,在免疫系統(tǒng)中執(zhí)行分泌細(xì)胞因子和其他免疫功能分子等多種功能,從而介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答。吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是存在于DCs的一種強(qiáng)效免疫酶,DCs表面的IDO與寄生蟲的免疫逃避有關(guān)。但旋毛蟲ES抗原通過何種途徑誘導(dǎo)DCs免疫耐受的分子逃避機(jī)制尚不清楚,IDO對(duì)參與蟲體免疫逃避的作用機(jī)制尚不明確。為了探究IDO介導(dǎo)免疫耐受與旋毛蟲免疫逃避之間存在的關(guān)系,本研究以小鼠骨髓來源的DCs為模型,設(shè)空白對(duì)照組、1640組、ES抗原組及IFN-γ組。DCs經(jīng)各組刺激劑作用后,細(xì)胞免疫熒光技術(shù)初步檢測(cè)IDO蛋白在DCs表面的表達(dá)情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD40、MHC-Ⅱ、CD80及CD86的表達(dá)情況,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)動(dòng)態(tài)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)IDO及下游細(xì)胞因子IL-10、TNF-α和IFN-γmRNA的表達(dá)水平,Western blot方法檢測(cè)IDO蛋白的表達(dá)水平。siRNA620干擾后,qRT-PCR法重新檢測(cè)IDO及下游相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平,Western blot方法檢測(cè)IDO蛋白的表達(dá)水平。根據(jù)GenBank中登錄的小鼠IDO,IFN-γ,TNF-α,IL-10和β-actin基因序列,分別設(shè)計(jì)合成熒光定量PCR引物,建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。細(xì)胞增殖活力(CCK-8)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ES抗原作用濃度0~25μg/mL內(nèi)對(duì)DCs活力無影響。qRT-PCR結(jié)果顯示,當(dāng)不同濃度的旋毛蟲ES抗原或作用時(shí)間不同時(shí),DCs的IDO mRNA表達(dá)量不同,并在一定時(shí)間內(nèi)與劑量和時(shí)間存在依賴性效應(yīng)。在0~24 h內(nèi),隨時(shí)間的增加,IDO mRNA表達(dá)量增加,與0h相比,24 h時(shí)IDO mRNA表達(dá)水平最高,差異最顯著(P0.001)。因此,15μg/mL的旋毛蟲ES抗原在24 h時(shí),能最大限度的促進(jìn)IDO mRNA的表達(dá),最終我們選擇15μg/mL的旋毛蟲ES抗原濃度作為工作濃度。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ES抗原能高效促進(jìn)IDO在DCs胞質(zhì)中的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,DCs經(jīng)旋毛蟲ES抗原、脂多糖(LPS)刺激后,其表面分子CD40、MHC-Ⅱ、CD80及CD86的表達(dá)水平都有不同程度的升高。LPS能顯著促進(jìn)DCs表面分子的高表達(dá),與ES抗原組相比差異顯著(P0.001),證明LPS能促進(jìn)DCs成熟,增強(qiáng)DCs的免疫活力。而經(jīng)ES抗原作用后,表面分子的表達(dá)并不顯著,抑制DCs的成熟,使其停留在半成熟狀態(tài),抑制DCs抗原提呈能力,促進(jìn)蟲體的免疫逃避。qRT-PCR結(jié)果表明,ES抗原能高效促進(jìn)IDO在DCs的表達(dá)。在0~24 h時(shí)間段內(nèi),DCs在15μg/mL的ES抗原刺激下,IDO mRNA的表達(dá)存在時(shí)間依賴效應(yīng),隨著時(shí)間的增加,IDO mRNA表達(dá)量顯著增加,24~72 h時(shí)間段內(nèi),IDO mRNA表達(dá)量逐漸降低,最后趨于平衡。ES抗原均能顯著促進(jìn)IDO下游抗炎因子IL-10和促炎因子TNF-α及IFN-γmRNA表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,ES抗原能顯著促進(jìn)DCs IDO蛋白的表達(dá),且在0~36 h時(shí)間內(nèi),IDO蛋白的表達(dá)水平持續(xù)升高,呈時(shí)間依賴性效應(yīng),36 h時(shí)表達(dá)水平到達(dá)峰值,隨后略有降低,趨于穩(wěn)定。DCs經(jīng)siRNA620干擾后,15μg/mL的ES抗原刺激36 h,qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)IDO mRNA及蛋白表達(dá)水平的抑制效率,qRT-PCR再次檢測(cè)下游細(xì)胞因子IL-10、TNF-α及IFN-γmRNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,siRNA620能有效抑制IDO mRNA及蛋白的表達(dá),與單ES抗原組相比,差異性顯著(P0.001);siRNA620干擾后,單ES抗原組相比,促炎因子TNF-α,IFN-γmRNA表達(dá)水平顯著升高,抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)水平顯著降低。以上結(jié)果證實(shí),在一定的劑量和時(shí)間的作用下,旋毛蟲ES抗原刺激DCs后,通過上調(diào)共刺激分子CD40、MHC-Ⅱ、CD80及CD86的表達(dá),誘導(dǎo)DCs表面IDO mRNA及蛋白表達(dá),從而上調(diào)促炎因子TNF-α,IFN-γ和抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá),使DCs處于免疫耐受狀態(tài),有助于旋毛蟲逃避機(jī)體識(shí)別,得以在宿主體內(nèi)持續(xù)生存,造成宿主持續(xù)性慢性感染。結(jié)果表明ES抗原對(duì)DCs的持續(xù)刺激可能通過IDO介導(dǎo)的炎癥相關(guān)信號(hào)誘導(dǎo)DCs處于免疫耐受狀態(tài)。這不僅為研究線蟲的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供了體外模型,也為臨床治療旋毛蟲病及研制有效的疫苗提供新的依據(jù)和思路。
【圖文】：

21：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：Eotein molecular weight Marker;3-1 ES 抗原的 SDS-PAGE 1 SDS-PAGE analysis of ES熒光檢測(cè)原、IFN-γ、1640 刺激 24促進(jìn) IDO 表達(dá)，在 DCs 的熒光，未見 IDO 表達(dá)。

圖 3-2 細(xì)胞免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同處理組 DCs 表達(dá) IDO 的情況Fig.3-2 Detection of IDO on DCs of different treatment groups by cellularimmunohistochemistry3.3 旋毛蟲 ES 抗原對(duì) DCs 增殖活力的影響
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.7

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3 吳e

本文編號(hào)：2659297