【摘要】：克隆牛乳腺炎糞腸球菌溶血素Cyla基因,構(gòu)建Cyla基因抗原優(yōu)勢區(qū)序列的重組原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中表達(dá),并對其表達(dá)蛋白的免疫反應(yīng)活性鑒定,為建立奶牛糞腸球菌性乳腺炎的流行病檢測奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。分離患乳腺炎的乳樣,分離出具有溶血表型的菌株,并提取其基因組DNA,通過16S rDNA序列分子鑒定,確定為糞腸球菌;根據(jù)GenBank公布的Cyla基因序列設(shè)計(jì)1對克隆引物,PCR擴(kuò)增出Cyla基因抗原優(yōu)勢序列,并構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-Cyla,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、表達(dá)并優(yōu)化誘導(dǎo)條件,通過SDS-PAGE電泳鑒定、Ni~(2+)親和層析純化、Western-blot鑒定表達(dá)蛋白的免疫反應(yīng)活性。測序結(jié)果顯示,成功克隆糞腸球菌溶血素Cyla基因,序列長度為1239 bp,共編碼413個氨基酸殘基。經(jīng)測序和酶切分析表明,成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-30a(+)-Cyla,在大腸桿菌感受態(tài)BL21細(xì)胞中獲得高效表達(dá),誘導(dǎo)產(chǎn)物相對分子質(zhì)量為44 ku,純化后的蛋白含量為2.44 mg/m L,經(jīng)Western-blot結(jié)果表明重組蛋白具有很好的免疫反應(yīng)原性。乳腺炎糞腸球菌溶血素Cyla基因的抗原表位序列編碼的蛋白具有良好的免疫反應(yīng)活性性,可以做為奶牛糞腸球菌性乳腺炎流行病檢測的活性抗原。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2658702