【摘要】：豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒性疫病是近年來養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中最為普遍和突出的問題,已給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害和損失。許多研究表明:豬流感病毒(SIV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、偽狂犬病毒(PRV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)等在臨床上多引起豬的呼吸道類與繁殖障礙類疫病,且常呈混合或繼發(fā)感染,導(dǎo)致了豬群的高發(fā)病率和高死亡率,使得診斷和防治難度加大。為實(shí)現(xiàn)臨床豬呼吸道類與繁殖障礙類病毒性疫病多種病原體混合感染的快速確診,本研究建立了針對(duì)上述病原體的七重PCR檢測(cè)方法并進(jìn)行了初步應(yīng)用,為相關(guān)疫病病原的快速診斷和防控提供了有效的技術(shù)手段,同時(shí)針對(duì)七重PCR檢測(cè)出的單一或混合感染的陽性病毒組織病料,進(jìn)行了部分病毒相關(guān)毒力基因或抗原基因的克隆及序列分析,從分子生物學(xué)角度分析貴州省近年來流行的部分豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒的遺傳變異情況,為今后這些病毒的防控提供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下:1.PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV七重PCR檢測(cè)方法的建立參照GenBank上PRRSV ORF6(AY262352)、PCV2 ORF2(KY806071)、PPV NS1(AY502114)、PRV gB(JX41771)、SIV M(LC371845)、JEV NS1(M55506)和CSFV E2(AF092448)等基因的部分片段,應(yīng)用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)了7對(duì)引物,分別用于擴(kuò)增PRRSV ORF6、PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、SIV M、JEV NS1和CSFV E2基因的部分片段。將實(shí)驗(yàn)室已保存的PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV等病毒接種到已長滿單層易感細(xì)胞上進(jìn)行病毒的增殖,分別提取毒液中的核酸作為模板,通過對(duì)7種病毒單一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定,并對(duì)其退火溫度和敏感性進(jìn)行優(yōu)化和檢測(cè),建立一種快速鑒別PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV等7種常見豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒的單一PCR檢測(cè)方法;在該方法的基礎(chǔ)上,選擇合適的七重PCR緩沖體系及酶,摸索退火溫度、模板及引物濃度,最后對(duì)七重PCR進(jìn)行特異性、敏感性及重復(fù)性檢測(cè),建立一種能夠同時(shí)且快速鑒別PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV等7種常見豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒性疫病的多重PCR檢測(cè)方法。單一病毒PCR檢測(cè)方法的建立結(jié)果表明:(1)最佳反應(yīng)體系:7對(duì)引物濃度均為10μmoL·L~(-1),PRRSV、PCV2、PPV上下游引物各1μL,PRV、SIV、JEV、CSFV上下游引物各1.5μL,模板DNA/cDNA各2μL,金牌MiX(Green)補(bǔ)足25μL。(2)最佳反應(yīng)條件:單一病毒PCR的退火溫度在50~60℃間均可擴(kuò)增出特異的條帶,7種病毒的最佳反應(yīng)程序均為:94℃5 min;94℃45 s;54℃45 s;72℃45 s,35個(gè)循環(huán);72℃10 min。(3)敏感性結(jié)果表明:7種病毒的最低核酸檢測(cè)量分別為:PRRSV 0.47 pg、PCV2 0.33 pg、PPV 34 pg、PRV 1.2pg、SIV 0.18pg、JEV 8.5 pg、CSFV 0.8 pg。七重PCR檢測(cè)方法的建立結(jié)果表明:(1)最佳反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)總體系為50μL時(shí)最佳,上下游引物濃度均為10μmoL·L~(-1),引物量PRRSV、PCV2、PPV、SIV各0.5μL,PRV、JEV、CSFV各1μL,DNA/cDNA模板:PRRSV、PCV2、PPV、SIV各1μL,PRV、JEV、CSFV各1.5μL,金牌MiX(Green)補(bǔ)足50μL。(2)最佳反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃45 s;54℃45 s;72℃45s,35個(gè)循環(huán);72℃10 min。(3)特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明:七重PCR能擴(kuò)增出PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV的特異性片段,分別為224 bp、353 bp、424 bp、549 bp、684 bp、831 bp、1 121 bp,未擴(kuò)增出E.coli、APP、PEDV及正常細(xì)胞組織的DNA/RNA;七重PCR中各種病毒的最低核酸檢測(cè)量分別為:PRRSV 94 pg、PCV2 66 pg、PPV 68 pg、PRV 20 pg、SIV 35 pg、JEV 17 pg和CSFV 14 pg;6次重復(fù)試驗(yàn)均能擴(kuò)增出一致的目的條帶。研究建立的豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒七重PCR檢測(cè)方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的特點(diǎn)。2.PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV七重PCR檢測(cè)方法在臨床樣品中的應(yīng)用應(yīng)用所建立的豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒性疫病七重PCR檢測(cè)方法對(duì)2017~2019年貴州部分地區(qū)的150份臨床病料進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明:150份臨床病料中2種病毒混合感染陽性率高達(dá)66%(99/150),其中PCV2+PRRSV混合感染的陽性率較高,達(dá)42.67%(66/150),PCV2+PRV混合感染的陽性率為8%(12/150)、PCV2+CSFV混合感染的陽性率為2.67%(4/150)、PCV2+JEV混合感染的陽性率為3.33%(5/150)、PCV2+PPV混合感染的陽性率為0.67%(1/150)、PRV+CSFV混合感染的陽性率為2%(3/150)、PRV+JEV混合感染的陽性率為5.33%(8/150);3種病毒混合感染陽性陽性率達(dá)11.33%(17/150),其中PCV2+SIV+JEV混合感染的陽性率為2%(3/150)、PCV2+PRV+JEV混合感染的陽性率為3.33%(5/150)、PCV2+PRRSV+CSFV混合感染的陽性率為1.33%(2/150)、PCV2+PRRSV+JEV混合感染的陽性率為4.67%(7/150);4種病毒PCV2+PRRSV+PRV+CSFV混合感染陽性率達(dá)2%(3/150),5種病毒PCV2+PRRSV+JEV+PRV+CSFV混合感染感染陽性率達(dá)0.67%(1/150);6種和7種病毒混合感染陽性率均為0。陽性PRRSV、PCV2、PPV、JEV、SIV的多重PCR與單一PCR的符合率均為100%,陽性CSFV和PRV的符合率為90%以上。3.規(guī)�；i場(chǎng)豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒部分流行毒株的遺傳變異研究參照GenBank上PRRSV ORF5和Nsp2(EF635006)、JEV E(M55506)、CSFV E2基因(AF092448)、PRV gE(KM061380)、PCV2全基因(KU041852)等基因的基因序列,用primer 5.0設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增目的基因片段的引物,基于對(duì)豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒性疫病混合感染情況的檢測(cè)及分析,選取本研究中經(jīng)七重PCR檢測(cè)結(jié)果為PRRSV、PCV2、PRV、JEV、CSFV單一或混合感染的陽性臨床病料為模板,對(duì)PRRSV ORF5和Nsp2基因、PCV2全基因、PRVgE基因、JEV E基因、CSFV E2基因進(jìn)行克隆和遺傳變異分析�？寺〉�4條PRV gE基因氨基酸序列在第48位和第496位各有1個(gè)天冬氨酸(D)的插入,且與2012年以來國內(nèi)不同省份分離的PRV變異株gE基因氨基酸序列在448位均由V→I,屬于PRV變異株�？寺〉�8條PCV2全基因序列均屬于PCV2d基因型�？寺〉�5條PRRSV ORF5基因在蛋白抗原表位:2個(gè)為非中和表位(aa27~aa30和aa180~aa197)和1個(gè)為中和表位(aa 37~aa 45)區(qū)域均未發(fā)生突變;此外,5條PRRSV Nsp2基因的蛋白均存在第481位和532~560位2處不連續(xù)的氨基酸缺失位點(diǎn),和高致病性豬藍(lán)耳病病毒毒株序列的缺失位點(diǎn)一致,為同一分支,親緣關(guān)系也最近�？寺〉�4條CSFV E2基因序列的病毒抗原性、毒力有關(guān)的氨基酸位點(diǎn)未發(fā)生大的變化,部分CSFV E2基因的24位G→E,36位N→D,45位K→R、49位V→T,貴州省的豬瘟病毒E2基因向遠(yuǎn)離經(jīng)典株和疫苗株的方向發(fā)展,和近年來流行的中國分離株處于同一遺傳進(jìn)化分支�？寺〉�4條JEV E基因序列在E304和E335兩個(gè)位點(diǎn)的Cys都沒有發(fā)生變異,在決定JEV毒力的10個(gè)關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)(E107、E138、E176、E177、E244、E264、E279、E315、E439、E447)上均無變異,在E60~68的氨基酸位點(diǎn)和疫苗株SA14-14-2株完全一致。
【圖文】：

A：正常 Vero 細(xì)胞；B：接 PRV 24 h；C：接 PRV 48 h；D：接 PRV 60 h；E：接 PRV 72 h；F：接 PRV 96 hA: normal Vero cells; B: connected to PRV 24 h; C: connected to PRV for 48 h;D: connected to PRV 60 h; E: connected to PRV 72 h; F: connected to PRV 96 h圖 2-1 PRV 在 Vero 細(xì)胞上的病變結(jié)果Fig. 2-1 Lesion of PRV on Vero cells3.1.2 PRRSV 的增殖取 0.5 mL PRRSV 接種長滿成單層的 Marc-145 細(xì)胞，，部分病料能在第一代使 Marc-145 細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞變圓、破碎、折光性改變、聚集，最后脫落的現(xiàn)象（圖2-2），傳代后出現(xiàn)毒力減弱現(xiàn)象。DE F

A：正常 BHK-21 細(xì)胞；B：接 JEV 12 h；C：接 JEV 24 h；D：接 JEV 48 h；E：接 JEV 72 h；F：接 JEV 96 hA: normal BHK-21 cells; B: JEV 12 h; C: JEV 24 h;D: JEV 48 h; E: JEV 72 h; F: JEV 96圖 2-3 JEV 在 BHK-21 細(xì)胞上的病變結(jié)果Fig.2-3 Lesion of JEV on BHK-21 cells.4 SIV 的增殖取 0.5 mLSIV 毒液接種于已長滿成單層的 MDCK 細(xì)胞，未出現(xiàn)明顯的象（圖 2-4）。DE
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.28

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李書勛;于虹;張濟(jì)福;;豬呼吸道系統(tǒng)的常見疾病及防治措施[J];中國動(dòng)物保健;2017年03期

2 李繼東;;規(guī)�；i場(chǎng)豬呼吸道疫病部分病原的分離[J];農(nóng)業(yè)科學(xué)研究;2009年02期

3 江國文;;豬呼吸道綜合癥狀防治技術(shù)[J];農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備;2017年01期

4 馬團(tuán)祥;劉漢高;邱凱;李先強(qiáng);;氟苯尼考與泰樂菌素對(duì)常見豬呼吸道病原菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)[J];塔里木大學(xué)學(xué)報(bào);2017年02期

5 陳艷萍;;豬呼吸道疫病發(fā)生原因與防治措施[J];中國畜禽種業(yè);2016年12期

6 黃利剛;;淺談豬呼吸道的三道防線[J];今日養(yǎng)豬業(yè);2017年03期

7 胡輝;余興龍;李杰;肖朝庭;李潤成;李斌;;豬呼吸道、消化道內(nèi)細(xì)菌質(zhì)粒的提取[J];湖北畜牧獸醫(yī);2011年09期

8 龔大春;江濤;周天明;程太平;;豬呼吸道正常菌叢對(duì)抗菌藥物敏感性的研究[J];長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)農(nóng)學(xué)卷;2009年04期

9 ;豬呼吸道生理[J];動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué);2005年06期

10 安國濤;尹曉龍;彭銘s

本文編號(hào)：2658479