【摘要】：豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒性疫病是近年來養(yǎng)豬生產(chǎn)實踐中最為普遍和突出的問題,已給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害和損失。許多研究表明:豬流感病毒(SIV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細小病毒(PPV)、偽狂犬病毒(PRV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)等在臨床上多引起豬的呼吸道類與繁殖障礙類疫病,且常呈混合或繼發(fā)感染,導致了豬群的高發(fā)病率和高死亡率,使得診斷和防治難度加大。為實現(xiàn)臨床豬呼吸道類與繁殖障礙類病毒性疫病多種病原體混合感染的快速確診,本研究建立了針對上述病原體的七重PCR檢測方法并進行了初步應用,為相關疫病病原的快速診斷和防控提供了有效的技術手段,同時針對七重PCR檢測出的單一或混合感染的陽性病毒組織病料,進行了部分病毒相關毒力基因或抗原基因的克隆及序列分析,從分子生物學角度分析貴州省近年來流行的部分豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒的遺傳變異情況,為今后這些病毒的防控提供理論依據(jù)。主要研究內容如下:1.PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV七重PCR檢測方法的建立參照GenBank上PRRSV ORF6(AY262352)、PCV2 ORF2(KY806071)、PPV NS1(AY502114)、PRV gB(JX41771)、SIV M(LC371845)、JEV NS1(M55506)和CSFV E2(AF092448)等基因的部分片段,應用相關軟件設計了7對引物,分別用于擴增PRRSV ORF6、PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、SIV M、JEV NS1和CSFV E2基因的部分片段。將實驗室已保存的PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV等病毒接種到已長滿單層易感細胞上進行病毒的增殖,分別提取毒液中的核酸作為模板,通過對7種病毒單一PCR擴增產(chǎn)物的鑒定,并對其退火溫度和敏感性進行優(yōu)化和檢測,建立一種快速鑒別PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV等7種常見豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒的單一PCR檢測方法;在該方法的基礎上,選擇合適的七重PCR緩沖體系及酶,摸索退火溫度、模板及引物濃度,最后對七重PCR進行特異性、敏感性及重復性檢測,建立一種能夠同時且快速鑒別PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV等7種常見豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒性疫病的多重PCR檢測方法。單一病毒PCR檢測方法的建立結果表明:(1)最佳反應體系:7對引物濃度均為10μmoL·L~(-1),PRRSV、PCV2、PPV上下游引物各1μL,PRV、SIV、JEV、CSFV上下游引物各1.5μL,模板DNA/cDNA各2μL,金牌MiX(Green)補足25μL。(2)最佳反應條件:單一病毒PCR的退火溫度在50~60℃間均可擴增出特異的條帶,7種病毒的最佳反應程序均為:94℃5 min;94℃45 s;54℃45 s;72℃45 s,35個循環(huán);72℃10 min。(3)敏感性結果表明:7種病毒的最低核酸檢測量分別為:PRRSV 0.47 pg、PCV2 0.33 pg、PPV 34 pg、PRV 1.2pg、SIV 0.18pg、JEV 8.5 pg、CSFV 0.8 pg。七重PCR檢測方法的建立結果表明:(1)最佳反應體系:PCR反應總體系為50μL時最佳,上下游引物濃度均為10μmoL·L~(-1),引物量PRRSV、PCV2、PPV、SIV各0.5μL,PRV、JEV、CSFV各1μL,DNA/cDNA模板:PRRSV、PCV2、PPV、SIV各1μL,PRV、JEV、CSFV各1.5μL,金牌MiX(Green)補足50μL。(2)最佳反應條件:94℃5 min;94℃45 s;54℃45 s;72℃45s,35個循環(huán);72℃10 min。(3)特異性、敏感性和重復性試驗結果表明:七重PCR能擴增出PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV的特異性片段,分別為224 bp、353 bp、424 bp、549 bp、684 bp、831 bp、1 121 bp,未擴增出E.coli、APP、PEDV及正常細胞組織的DNA/RNA;七重PCR中各種病毒的最低核酸檢測量分別為:PRRSV 94 pg、PCV2 66 pg、PPV 68 pg、PRV 20 pg、SIV 35 pg、JEV 17 pg和CSFV 14 pg;6次重復試驗均能擴增出一致的目的條帶。研究建立的豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒七重PCR檢測方法具有敏感性高、特異性強和重復性好的特點。2.PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV七重PCR檢測方法在臨床樣品中的應用應用所建立的豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒性疫病七重PCR檢測方法對2017~2019年貴州部分地區(qū)的150份臨床病料進行檢測。結果表明:150份臨床病料中2種病毒混合感染陽性率高達66%(99/150),其中PCV2+PRRSV混合感染的陽性率較高,達42.67%(66/150),PCV2+PRV混合感染的陽性率為8%(12/150)、PCV2+CSFV混合感染的陽性率為2.67%(4/150)、PCV2+JEV混合感染的陽性率為3.33%(5/150)、PCV2+PPV混合感染的陽性率為0.67%(1/150)、PRV+CSFV混合感染的陽性率為2%(3/150)、PRV+JEV混合感染的陽性率為5.33%(8/150);3種病毒混合感染陽性陽性率達11.33%(17/150),其中PCV2+SIV+JEV混合感染的陽性率為2%(3/150)、PCV2+PRV+JEV混合感染的陽性率為3.33%(5/150)、PCV2+PRRSV+CSFV混合感染的陽性率為1.33%(2/150)、PCV2+PRRSV+JEV混合感染的陽性率為4.67%(7/150);4種病毒PCV2+PRRSV+PRV+CSFV混合感染陽性率達2%(3/150),5種病毒PCV2+PRRSV+JEV+PRV+CSFV混合感染感染陽性率達0.67%(1/150);6種和7種病毒混合感染陽性率均為0。陽性PRRSV、PCV2、PPV、JEV、SIV的多重PCR與單一PCR的符合率均為100%,陽性CSFV和PRV的符合率為90%以上。3.規(guī)�；i場豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒部分流行毒株的遺傳變異研究參照GenBank上PRRSV ORF5和Nsp2(EF635006)、JEV E(M55506)、CSFV E2基因(AF092448)、PRV gE(KM061380)、PCV2全基因(KU041852)等基因的基因序列,用primer 5.0設計用于擴增目的基因片段的引物,基于對豬呼吸道類和繁殖障礙類病毒性疫病混合感染情況的檢測及分析,選取本研究中經(jīng)七重PCR檢測結果為PRRSV、PCV2、PRV、JEV、CSFV單一或混合感染的陽性臨床病料為模板,對PRRSV ORF5和Nsp2基因、PCV2全基因、PRVgE基因、JEV E基因、CSFV E2基因進行克隆和遺傳變異分析�？寺〉�4條PRV gE基因氨基酸序列在第48位和第496位各有1個天冬氨酸(D)的插入,且與2012年以來國內不同省份分離的PRV變異株gE基因氨基酸序列在448位均由V→I,屬于PRV變異株�？寺〉�8條PCV2全基因序列均屬于PCV2d基因型�？寺〉�5條PRRSV ORF5基因在蛋白抗原表位:2個為非中和表位(aa27~aa30和aa180~aa197)和1個為中和表位(aa 37~aa 45)區(qū)域均未發(fā)生突變;此外,5條PRRSV Nsp2基因的蛋白均存在第481位和532~560位2處不連續(xù)的氨基酸缺失位點,和高致病性豬藍耳病病毒毒株序列的缺失位點一致,為同一分支,親緣關系也最近�？寺〉�4條CSFV E2基因序列的病毒抗原性、毒力有關的氨基酸位點未發(fā)生大的變化,部分CSFV E2基因的24位G→E,36位N→D,45位K→R、49位V→T,貴州省的豬瘟病毒E2基因向遠離經(jīng)典株和疫苗株的方向發(fā)展,和近年來流行的中國分離株處于同一遺傳進化分支�？寺〉�4條JEV E基因序列在E304和E335兩個位點的Cys都沒有發(fā)生變異,在決定JEV毒力的10個關鍵性氨基酸位點(E107、E138、E176、E177、E244、E264、E279、E315、E439、E447)上均無變異,在E60~68的氨基酸位點和疫苗株SA14-14-2株完全一致。
【圖文】：

A：正常 Vero 細胞；B：接 PRV 24 h；C：接 PRV 48 h；D：接 PRV 60 h；E：接 PRV 72 h；F：接 PRV 96 hA: normal Vero cells; B: connected to PRV 24 h; C: connected to PRV for 48 h;D: connected to PRV 60 h; E: connected to PRV 72 h; F: connected to PRV 96 h圖 2-1 PRV 在 Vero 細胞上的病變結果Fig. 2-1 Lesion of PRV on Vero cells3.1.2 PRRSV 的增殖取 0.5 mL PRRSV 接種長滿成單層的 Marc-145 細胞，，部分病料能在第一代使 Marc-145 細胞出現(xiàn)細胞變圓、破碎、折光性改變、聚集，最后脫落的現(xiàn)象（圖2-2），傳代后出現(xiàn)毒力減弱現(xiàn)象。DE F

A：正常 BHK-21 細胞；B：接 JEV 12 h；C：接 JEV 24 h；D：接 JEV 48 h；E：接 JEV 72 h；F：接 JEV 96 hA: normal BHK-21 cells; B: JEV 12 h; C: JEV 24 h;D: JEV 48 h; E: JEV 72 h; F: JEV 96圖 2-3 JEV 在 BHK-21 細胞上的病變結果Fig.2-3 Lesion of JEV on BHK-21 cells.4 SIV 的增殖取 0.5 mLSIV 毒液接種于已長滿成單層的 MDCK 細胞，未出現(xiàn)明顯的象（圖 2-4）。DE
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28

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本文編號：2658479