【摘要】：近年來,禽類養(yǎng)殖業(yè)在不斷擴大,人們對于禽肉和蛋類的消費水平也在不斷提升,但抗生素藥物濫用現(xiàn)象愈來愈嚴重,各種超級細菌和病毒層出不窮,傳統(tǒng)的禽類疫苗已經(jīng)無法滿足市場需求,開發(fā)新型疫苗迫在眉睫。目前已經(jīng)開發(fā)出的新型疫苗需要佐劑的添加來提高其免疫水平,干擾素和補體分子是目前已證明的具有佐劑效應(yīng)的活性分子,但目前的報道都是對二者單獨進行的,本實驗欲將IFN-γ和補體C3d串聯(lián)表達,并與單獨表達的IFN-γ對比,觀察其抗病毒活性。本實驗成功獲取了目的基因chIFN-γ和chIFN-γ-C3d,并構(gòu)建了真核重組質(zhì)粒pPICZαA-chIFN-γ和pPICZαA-chIFN-γ-C3d,通過酶切鑒定和測序鑒定來驗證構(gòu)建的正確性。構(gòu)建成功后,將真核質(zhì)粒pPICZαA-chIFN-γ和pPICZαA-chIFN-γ-C3d線性化后電轉(zhuǎn)化導入畢赤酵母SMD1168中,甲醇誘導目的蛋白的表達,并對其最佳誘導時間進行了選擇。SDS-PAGE結(jié)果表明,chIFN-γ和chIFN-γ-C3d在17KDa和21KDa各有一個條帶,與理論值相符,Western-Blotting檢測也驗證了目的蛋白表達的正確性。重組蛋白表達成功后,用鎳柱對重組蛋白進行純化,純化后蛋白濃度為chIFN-γ0.427mg/mL,chIFN-γ-C3d 1.069mg/mL。將本實驗中真核表達的重組蛋白chIFN-γ和chIFN-γ-C3d以及實驗室保存的原核表達的重組蛋白chIFN-γ和chIFN-γ-C3d進行雞胚內(nèi)和雞胚成纖維細胞(CEF)抗病毒活性比較。在雞胚內(nèi)進行的抗病毒實驗結(jié)果表明,四個重組蛋白均具有較好的抗病毒活性,與病毒組相比差異極顯著(P0.01),在低濃度時,chIFN-γ比chIFN-γ-C3d效果好,高濃度時,chIFN-γ-C3d組病毒滴度明顯下降,差異極顯著(P0.01),原核表達的chIFN-γ-C3d與真核表達的chIFN-γ-C3d抗病毒活性差異不顯著(P0.05),在CEF上進行的抗病毒實驗結(jié)果表明在相同處理方式下,從病毒滴度測定結(jié)果來看,四個重組蛋白之間無明顯差異,但chIFN-γ-C3d效果要好于chIFN-γ,MTT測定表明四個重組蛋白抗病毒效果顯著,與病毒組相比差異極顯著(P0.01)。四個重組蛋白都隨著濃度的增大抗病毒效果逐漸增強,但差異不顯著(P0.05)�？傮w來看,chIFN-γ-C3d效果要好于chIFN-γ,本實驗真核表達的重組蛋白好于實驗室保存的原核表達的重組蛋白,但差異不顯著(P0.05)。綜上所述,本實驗成功在畢赤酵母中表達了重組蛋白chIFN-γ和chIFN-γ-C3d,它們都具有良好的抗病毒活性,為后面進行免疫佐劑功能研究奠定了基礎(chǔ),也為新型疫苗免疫佐劑開發(fā)提供了一種新的思路。
【學位授予單位】：河南科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;S852.4

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本文編號：2658457