【摘要】：近年來(lái),禽類養(yǎng)殖業(yè)在不斷擴(kuò)大,人們對(duì)于禽肉和蛋類的消費(fèi)水平也在不斷提升,但抗生素藥物濫用現(xiàn)象愈來(lái)愈嚴(yán)重,各種超級(jí)細(xì)菌和病毒層出不窮,傳統(tǒng)的禽類疫苗已經(jīng)無(wú)法滿足市場(chǎng)需求,開(kāi)發(fā)新型疫苗迫在眉睫。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出的新型疫苗需要佐劑的添加來(lái)提高其免疫水平,干擾素和補(bǔ)體分子是目前已證明的具有佐劑效應(yīng)的活性分子,但目前的報(bào)道都是對(duì)二者單獨(dú)進(jìn)行的,本實(shí)驗(yàn)欲將IFN-γ和補(bǔ)體C3d串聯(lián)表達(dá),并與單獨(dú)表達(dá)的IFN-γ對(duì)比,觀察其抗病毒活性。本實(shí)驗(yàn)成功獲取了目的基因chIFN-γ和chIFN-γ-C3d,并構(gòu)建了真核重組質(zhì)粒pPICZαA-chIFN-γ和pPICZαA-chIFN-γ-C3d,通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序鑒定來(lái)驗(yàn)證構(gòu)建的正確性。構(gòu)建成功后,將真核質(zhì)粒pPICZαA-chIFN-γ和pPICZαA-chIFN-γ-C3d線性化后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母SMD1168中,甲醇誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),并對(duì)其最佳誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了選擇。SDS-PAGE結(jié)果表明,chIFN-γ和chIFN-γ-C3d在17KDa和21KDa各有一個(gè)條帶,與理論值相符,Western-Blotting檢測(cè)也驗(yàn)證了目的蛋白表達(dá)的正確性。重組蛋白表達(dá)成功后,用鎳柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,純化后蛋白濃度為chIFN-γ0.427mg/mL,chIFN-γ-C3d 1.069mg/mL。將本實(shí)驗(yàn)中真核表達(dá)的重組蛋白chIFN-γ和chIFN-γ-C3d以及實(shí)驗(yàn)室保存的原核表達(dá)的重組蛋白chIFN-γ和chIFN-γ-C3d進(jìn)行雞胚內(nèi)和雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)抗病毒活性比較。在雞胚內(nèi)進(jìn)行的抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,四個(gè)重組蛋白均具有較好的抗病毒活性,與病毒組相比差異極顯著(P0.01),在低濃度時(shí),chIFN-γ比chIFN-γ-C3d效果好,高濃度時(shí),chIFN-γ-C3d組病毒滴度明顯下降,差異極顯著(P0.01),原核表達(dá)的chIFN-γ-C3d與真核表達(dá)的chIFN-γ-C3d抗病毒活性差異不顯著(P0.05),在CEF上進(jìn)行的抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在相同處理方式下,從病毒滴度測(cè)定結(jié)果來(lái)看,四個(gè)重組蛋白之間無(wú)明顯差異,但chIFN-γ-C3d效果要好于chIFN-γ,MTT測(cè)定表明四個(gè)重組蛋白抗病毒效果顯著,與病毒組相比差異極顯著(P0.01)。四個(gè)重組蛋白都隨著濃度的增大抗病毒效果逐漸增強(qiáng),但差異不顯著(P0.05)�？傮w來(lái)看,chIFN-γ-C3d效果要好于chIFN-γ,本實(shí)驗(yàn)真核表達(dá)的重組蛋白好于實(shí)驗(yàn)室保存的原核表達(dá)的重組蛋白,但差異不顯著(P0.05)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功在畢赤酵母中表達(dá)了重組蛋白chIFN-γ和chIFN-γ-C3d,它們都具有良好的抗病毒活性,為后面進(jìn)行免疫佐劑功能研究奠定了基礎(chǔ),也為新型疫苗免疫佐劑開(kāi)發(fā)提供了一種新的思路。
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;S852.4

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本文編號(hào)：2658457