發(fā)布時間：2020-05-10 13:36

【摘要】：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)是寄生于反芻動物皺胃的重要致病性寄生線蟲之一,能引起宿主消瘦、貧血和衰弱等臨床癥狀,嚴(yán)重時可致病宿死亡,給全球畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的治療主要依賴于化學(xué)藥物,尚未有可行性的疫苗應(yīng)用于臨床。然而化學(xué)藥物的長期大量使用,不僅造成了嚴(yán)重的藥物殘留問題,還使世界各地產(chǎn)生多種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲抗藥蟲株,因此研發(fā)新的藥物靶標(biāo)和疫苗候選分子對防治捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病尤為重要。Dauer假說提出寄生線蟲感染性三期幼蟲(iL3)與秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)dauer幼蟲在形態(tài)發(fā)育和調(diào)控機制上均有相似之處,這為研究寄生線蟲發(fā)育機制提供了新的思路。秀麗新桿線蟲中調(diào)控dauer形成的信號傳導(dǎo)通路有環(huán)鳥苷酸信號通路、dauerβ轉(zhuǎn)化生長因子樣信號通路、胰島素樣生長因子信號通路和激素樣通路四種,其中胰島素樣生長因子信號通路被證實存在于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中,并且該通路中的重要分子如胰島素樣受體Hc-DAF-2、磷脂酰肌醇3-激酶Hc-AGE-1和Hc-AAP-1,3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶Hc-PDK-1和叉頭轉(zhuǎn)錄因子Hc-DAF-16等在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的發(fā)育過程中均起到重要調(diào)控作用。這為dauer假說應(yīng)用于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的發(fā)育機制研究提供了實質(zhì)性依據(jù),但我們對dauerβ轉(zhuǎn)化生長因子樣信號通路(TGFβ信號通路)在調(diào)控捻轉(zhuǎn)血矛線蟲發(fā)育中的作用仍然一無所知。本研究通過分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法分離得到了TGFβ信號通路(DAF-7通路)中重要分子TGFβ配體(Hc-tgh-2)、TGFβI型受體(Hc-tgfbr1)和TGFβII型受體(Hc-tgfbr2),并分析了這三個基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平;利用異源轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究了Hc-tgfbr1和Hc-tgfbr2在秀麗新桿線蟲中的空間表達(dá)譜,并用基因救援方法檢測了Hc-tgfbr1對于秀麗新桿線蟲daf-1(DR40)突變株的救援作用;分別用原核表達(dá)的三個蛋白免疫家兔制備多克隆抗體檢測相應(yīng)蛋白在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲中的定位;利用TGFβI型受體特異性抑制劑LY2157299和RNAi技術(shù)研究了這三個基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲發(fā)育過程中的調(diào)控作用。(1)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲TGFβI型受體(Hc-tgfbr1)的基因結(jié)構(gòu)和功能研究Hc-tgfbr1的全長gDNA為4,998 bp,含16個外顯子和15個內(nèi)含子;全長CDS為1,779bp,可編碼592個氨基酸。進化分析顯示,Hc-TGFBR1屬于TGFβI型受體蛋白家族;氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)Hc-TGFBR1具有TGFβI型受體保守的功能域,其胞外含有保守的半胱氨酸殘基數(shù)個,胞內(nèi)有TGFβI型受體特有的甘氨酸絲氨酸富集功能域(GS功能域)和保守的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶區(qū)。轉(zhuǎn)錄水平分析顯示Hc-tgfbr1在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲不同發(fā)育階段持續(xù)表達(dá),在寄生雌蟲和iL3轉(zhuǎn)錄水平較高。TGFβI型受體特異性抑制劑LY2157299和特異性Hc-tgfbr1 dsRNA均可導(dǎo)致捻轉(zhuǎn)血矛線蟲xL3發(fā)育至L4的比例明顯下降。免疫組織化學(xué)方法檢測Hc-TGFBR1蛋白定位在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲的腸道細(xì)胞、外角質(zhì)層以及性腺等處;異源轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)果顯示Hc-tgfbr1能特異性表達(dá)在秀麗新桿線蟲的部分腸道細(xì)胞(int I和int IX),但是該基因?qū)τ谛沱愋聴U線蟲daf-1(DR40)突變株沒有救援效果。(2)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲TGFβII型受體(Hc-tgfbr2)的基因結(jié)構(gòu)和功能研究Hc-tgfbr2的全長gDNA為16,150 bp,含16個外顯子和15個內(nèi)含子;全長CDS為1,998 bp,可編碼665個氨基酸。進化分析顯示Hc-TGFBR2為TGFβII型受體家族成員,氨基酸序列比對顯示該蛋白為跨膜絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶,胞外含有一個由多個保守的半胱氨酸參與組成的TGFβII型受體典型cluster結(jié)構(gòu)(CXCX_4C),胞內(nèi)含有保守的蛋白激酶區(qū)。轉(zhuǎn)錄水平分析顯示Hc-tgfbr2在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲各個階段均有轉(zhuǎn)錄,其中在iL3階段轉(zhuǎn)錄水平最高,其次是雄性成蟲階段。體外RNAi實驗顯示Hc-tgfbr2轉(zhuǎn)錄水平的降低能導(dǎo)致捻轉(zhuǎn)血矛線蟲xL3發(fā)育至L4的比例明顯下降。免疫組織化學(xué)實驗顯示Hc-TGFBR2蛋白定位于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲腸道和性腺;異源轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)果顯示Hc-tgfbr2能特異性表達(dá)在秀麗新桿線蟲的腸道細(xì)胞和咽部后球部。(3)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲TGFβ配體(Hc-tgh-2)的基因結(jié)構(gòu)和功能研究Hc-tgh-2的全長gDNA為14,938 bp,含10個外顯子和9個內(nèi)含子;全長CDS為1,050bp,可編碼349個氨基酸。進化分析顯示Hc-TGH-2為TGFβ配體家族成員,氨基酸序列比對顯示該蛋白具有保守的TGFβ2配體結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域中存在多個保守的半胱氨酸殘基。轉(zhuǎn)錄水平分析顯示Hc-tgh-2在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的8個不同發(fā)育階段均有轉(zhuǎn)錄,但轉(zhuǎn)錄水平普遍偏低,其中iL3階段轉(zhuǎn)錄水平最高。體外RNAi實驗顯示Hc-tgh-2轉(zhuǎn)錄水平的降低可導(dǎo)致捻轉(zhuǎn)血矛線蟲xL3發(fā)育至L4的比例明顯下降。免疫組織化學(xué)實驗顯示Hc-TGH-2蛋白定位于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲腸道、外角質(zhì)層和性腺等部位。本研究首次探索了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲TGFβ信號通路(DAF-7通路)的三個重要分子的基因結(jié)構(gòu)和功能,深入探討了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲發(fā)育機制尤其是從自由生活向寄生生活階段轉(zhuǎn)變過程的調(diào)控機制,為開發(fā)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲新的藥物靶標(biāo)和疫苗候選分子提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

此后移行至皺胃，，在皺胃內(nèi)經(jīng)過兩次蛻皮分別發(fā)育成四期幼蟲（L4）和成蟲（adult），此過程約需 3 周（圖1-1）（Nikolaou and Gasser 2006）。此后捻轉(zhuǎn)血矛線蟲一直寄生于宿主皺胃內(nèi)，偶有部分成蟲寄生于小腸，成蟲產(chǎn)卵隨糞便排出體外進行新一輪發(fā)育（李國清 2006；宋銘忻和張龍現(xiàn) 2009）。圖 1-1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲生活史（Nikolaou and Gasser 2006）Fig. 1-1 Life cycle of Haemonchus contortus (Nikolaou and Gasser 2006)

圖 1-2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲部分形態(tài)（李國清 2006）1：成蟲頭部；2：雌性成蟲生殖孔部；3：雄性成蟲交合傘Fig. 1-2 Partial morphology of Haemonchus contortus (Guoqing Li 2006)terior end of adults; 2: Genital pore of female adult; 3: Copulatory bursa of male adu
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.731

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