發(fā)布時間：2020-05-10 13:17

【摘要】：睪丸作為哺乳動物繁衍的重要生殖器官,主要負責(zé)雄性配子的產(chǎn)生以及固醇類性激素的釋放。外力、生化或疾病等因素都可能損傷單側(cè)睪丸并影響其正常的功能,甚至造成生殖障礙。單去勢作為一種單側(cè)睪丸摘除手術(shù)能夠去除受損的睪丸,同時引起剩余睪丸激素的改變和代償性應(yīng)答,并且可能影響精子的發(fā)生。但是,其中可能存在的分子機制還有待進一步地探討。因此,本試驗中我們將探究單去勢對剩余睪丸功能的影響。青春期前的小鼠(24日齡)被實施單去勢手術(shù),并且測定小鼠的生長發(fā)育相關(guān)指標直至它們到達體成熟(72日齡)。接著,我們通過簡并代表性亞硫酸氫鹽測序技術(shù)測定了正常和單去勢小鼠剩余睪丸的DNA甲基化模式。同時,我們使用RNA測序技術(shù)描繪了睪丸基因的表達模式以探究單去勢小鼠基因表達與DNA甲基化之間的關(guān)系,并探討了lncRNA可能通過改變DNA甲基化進而調(diào)控生精相關(guān)基因的表達。結(jié)果如下:(1)相較對照組小鼠,單去勢并沒有顯著影響小鼠的生長或睪酮水平(P0.05),小鼠剩余睪丸并沒有出現(xiàn)組織學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)的變異。(2)剩余睪丸的全基因組DNA甲基化模式表明大量基因在基因體區(qū)域含有差異甲基化區(qū)域(1,139),這些基因的功能主要富集于蛋白的結(jié)合和細胞黏附。(3)mRNA分析結(jié)果顯示,46個差異表達基因(Differentially expressed genes,DEGs)在單去勢組中表達上調(diào),其功能涉及減數(shù)分裂細胞循環(huán)、聯(lián)會復(fù)合物的裝配和精子發(fā)生。同時,197個DEGs表達下調(diào),同肽鏈內(nèi)切酶抑制劑的活性以及花生四烯酸的代謝通路有關(guān)。(4)19個lncRNA出現(xiàn)差異表達,cis和trans分析結(jié)果顯示lncRNA-9230019H11Rik、lncRNA-Gm13652和lncRNA-Gm30934的功能可能同肽酶抑制劑的活性有關(guān);lncRNA-1700095K22Rik和lncRNA-Gm36525的功能顯著富集于氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運;lncRNA-1700061I17Rik、lncRNA-4930432O09Rik和lncrRNA-4930401O12Rik的潛在功能為花生四烯酸的代謝。(5)聯(lián)合分析顯示,負責(zé)編碼精母細胞同源重組的關(guān)鍵蛋白的基因PSMC3IP(Proteasome 26S subunit ATPase 3 interacting protein),在單去勢小鼠中表現(xiàn)出啟動子區(qū)域低甲基化且表達水平升高,并且與3個lncRNA(lncrRNA-4930401O12Rik、lncRNA-9230019H11Rik和lncRNA-Gm13652)的表達顯著負相關(guān)。單去勢引起的小鼠睪丸全基因組DNA甲基化的變化與睪丸功能有關(guān),并且調(diào)控相關(guān)基因的表達以參與精子的發(fā)生。
【圖文】：

圖 1-1 睪丸的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生的過程（此圖引用于 L.B. Smith and W.H. Walker, 2014[14]）Fig.1-1 The anatomy of the testis and the process of spermatogenesis1.1.2 單去勢對于睪丸影響的研究進展外力、生化影響或疾病等因素都可能損傷單側(cè)睪丸，進而導(dǎo)致機體的生殖障礙。單去勢作為一種單側(cè)睪丸摘除術(shù)，能夠去除受損的睪丸。有研究表明單去勢可以提供初始精子含量和分布的情況，并可以作為一種理想的模型用于研究睪丸的調(diào)控和發(fā)育[15, 16]。對青春期前的公牛和大鼠實施單去勢會造成其剩余睪丸的肥大，這可能同血清中促卵泡激素水平的變化有關(guān)[17, 18]。同樣，對綿羊和種馬實施單去勢后，會觀察到睪丸的肥大現(xiàn)象[19, 20]。為進一步探究單去勢后造成睪丸代償性肥大的機理，Lunstra 等通過對不同發(fā)育階段的雄性豬進行單去勢后發(fā)現(xiàn)，代償性肥大的效果同實施單去勢的時間早晚呈負相關(guān)，年紀越小肥大越明顯，同時，對睪丸間質(zhì)細胞和支持細胞的數(shù)量進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)單去勢后剩余睪丸的肥大可能同間質(zhì)細胞的增殖以及支持細胞的增生2

圖 4-1 72 日齡對照組小鼠（左圖）和單去勢小鼠（右圖）右側(cè)睪丸經(jīng)蘇木精和伊紅的石蠟切片。標尺：100 μmFig. 4-1 Hematoxylin & Eosin (H&E) staining of paraffin sections of right testis from 72 days-oldcontrol (left) and hemicastrated (right) mice. Scale bar:100 μm4.2 單去勢引起了睪丸 DNA 的差異甲基化為了探究單去勢小鼠睪丸 DNA 甲基化的變化，從 72 日齡對照組和單去勢組小鼠中分別挑選三個生物學(xué)重復(fù)，抽提其睪丸 DNA 進行 RRBS 建庫測序。測序結(jié)果如下表，reads 長度為 100 bp，，每個樣本得到平均約 5G 的數(shù)據(jù)，GC 含量約為 32%，比對率在 80%以上（表 4-2）。表 4-2 簡化的亞硫酸氫鹽測序比對到參考基因組的結(jié)果Table 2 Summary of reduced representation bisulfite sequencing read alignment to the referencegenomeIndividual Read leghth (bp） Clean data GC (%) Aligned (%) Unique (%)Control 1 100 52,392,308 32.72 83.96 67.05
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S814.1

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本文編號：2657359