【摘要】：睪丸作為哺乳動(dòng)物繁衍的重要生殖器官,主要負(fù)責(zé)雄性配子的產(chǎn)生以及固醇類性激素的釋放。外力、生化或疾病等因素都可能損傷單側(cè)睪丸并影響其正常的功能,甚至造成生殖障礙。單去勢(shì)作為一種單側(cè)睪丸摘除手術(shù)能夠去除受損的睪丸,同時(shí)引起剩余睪丸激素的改變和代償性應(yīng)答,并且可能影響精子的發(fā)生。但是,其中可能存在的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步地探討。因此,本試驗(yàn)中我們將探究單去勢(shì)對(duì)剩余睪丸功能的影響。青春期前的小鼠(24日齡)被實(shí)施單去勢(shì)手術(shù),并且測(cè)定小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)指標(biāo)直至它們到達(dá)體成熟(72日齡)。接著,我們通過(guò)簡(jiǎn)并代表性亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)測(cè)定了正常和單去勢(shì)小鼠剩余睪丸的DNA甲基化模式。同時(shí),我們使用RNA測(cè)序技術(shù)描繪了睪丸基因的表達(dá)模式以探究單去勢(shì)小鼠基因表達(dá)與DNA甲基化之間的關(guān)系,并探討了lncRNA可能通過(guò)改變DNA甲基化進(jìn)而調(diào)控生精相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果如下:(1)相較對(duì)照組小鼠,單去勢(shì)并沒(méi)有顯著影響小鼠的生長(zhǎng)或睪酮水平(P0.05),小鼠剩余睪丸并沒(méi)有出現(xiàn)組織學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)的變異。(2)剩余睪丸的全基因組DNA甲基化模式表明大量基因在基因體區(qū)域含有差異甲基化區(qū)域(1,139),這些基因的功能主要富集于蛋白的結(jié)合和細(xì)胞黏附。(3)mRNA分析結(jié)果顯示,46個(gè)差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs)在單去勢(shì)組中表達(dá)上調(diào),其功能涉及減數(shù)分裂細(xì)胞循環(huán)、聯(lián)會(huì)復(fù)合物的裝配和精子發(fā)生。同時(shí),197個(gè)DEGs表達(dá)下調(diào),同肽鏈內(nèi)切酶抑制劑的活性以及花生四烯酸的代謝通路有關(guān)。(4)19個(gè)lncRNA出現(xiàn)差異表達(dá),cis和trans分析結(jié)果顯示lncRNA-9230019H11Rik、lncRNA-Gm13652和lncRNA-Gm30934的功能可能同肽酶抑制劑的活性有關(guān);lncRNA-1700095K22Rik和lncRNA-Gm36525的功能顯著富集于氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn);lncRNA-1700061I17Rik、lncRNA-4930432O09Rik和lncrRNA-4930401O12Rik的潛在功能為花生四烯酸的代謝。(5)聯(lián)合分析顯示,負(fù)責(zé)編碼精母細(xì)胞同源重組的關(guān)鍵蛋白的基因PSMC3IP(Proteasome 26S subunit ATPase 3 interacting protein),在單去勢(shì)小鼠中表現(xiàn)出啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化且表達(dá)水平升高,并且與3個(gè)lncRNA(lncrRNA-4930401O12Rik、lncRNA-9230019H11Rik和lncRNA-Gm13652)的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。單去勢(shì)引起的小鼠睪丸全基因組DNA甲基化的變化與睪丸功能有關(guān),并且調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)以參與精子的發(fā)生。
【圖文】：

圖 1-1 睪丸的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生的過(guò)程（此圖引用于 L.B. Smith and W.H. Walker, 2014[14]）Fig.1-1 The anatomy of the testis and the process of spermatogenesis1.1.2 單去勢(shì)對(duì)于睪丸影響的研究進(jìn)展外力、生化影響或疾病等因素都可能損傷單側(cè)睪丸，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體的生殖障礙。單去勢(shì)作為一種單側(cè)睪丸摘除術(shù)，能夠去除受損的睪丸。有研究表明單去勢(shì)可以提供初始精子含量和分布的情況，并可以作為一種理想的模型用于研究睪丸的調(diào)控和發(fā)育[15, 16]。對(duì)青春期前的公牛和大鼠實(shí)施單去勢(shì)會(huì)造成其剩余睪丸的肥大，這可能同血清中促卵泡激素水平的變化有關(guān)[17, 18]。同樣，對(duì)綿羊和種馬實(shí)施單去勢(shì)后，會(huì)觀察到睪丸的肥大現(xiàn)象[19, 20]。為進(jìn)一步探究單去勢(shì)后造成睪丸代償性肥大的機(jī)理，Lunstra 等通過(guò)對(duì)不同發(fā)育階段的雄性豬進(jìn)行單去勢(shì)后發(fā)現(xiàn)，代償性肥大的效果同實(shí)施單去勢(shì)的時(shí)間早晚呈負(fù)相關(guān)，年紀(jì)越小肥大越明顯，同時(shí)，對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)單去勢(shì)后剩余睪丸的肥大可能同間質(zhì)細(xì)胞的增殖以及支持細(xì)胞的增生2

圖 4-1 72 日齡對(duì)照組小鼠（左圖）和單去勢(shì)小鼠（右圖）右側(cè)睪丸經(jīng)蘇木精和伊紅的石蠟切片。標(biāo)尺：100 μmFig. 4-1 Hematoxylin & Eosin (H&E) staining of paraffin sections of right testis from 72 days-oldcontrol (left) and hemicastrated (right) mice. Scale bar:100 μm4.2 單去勢(shì)引起了睪丸 DNA 的差異甲基化為了探究單去勢(shì)小鼠睪丸 DNA 甲基化的變化，從 72 日齡對(duì)照組和單去勢(shì)組小鼠中分別挑選三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，抽提其睪丸 DNA 進(jìn)行 RRBS 建庫(kù)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如下表，reads 長(zhǎng)度為 100 bp，，每個(gè)樣本得到平均約 5G 的數(shù)據(jù)，GC 含量約為 32%，比對(duì)率在 80%以上（表 4-2）。表 4-2 簡(jiǎn)化的亞硫酸氫鹽測(cè)序比對(duì)到參考基因組的結(jié)果Table 2 Summary of reduced representation bisulfite sequencing read alignment to the referencegenomeIndividual Read leghth (bp） Clean data GC (%) Aligned (%) Unique (%)Control 1 100 52,392,308 32.72 83.96 67.05
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S814.1

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