【摘要】：由一種或多種艾美耳球蟲引起的雞球蟲病是危害養(yǎng)雞業(yè)最嚴(yán)重的寄生蟲病,每年可造成世界范圍內(nèi)高達(dá)30億美元的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)雞球蟲病的有效防控,取決于對(duì)球蟲入侵、寄生及致病機(jī)制的充分了解。其中,雞球蟲對(duì)宿主細(xì)胞的入侵是建立感染的第一步,也是進(jìn)行球蟲病防控的最佳時(shí)期。目前對(duì)于雞球蟲入侵機(jī)制及其與宿主相互作用的了解,大多間接來源于弓形蟲和瘧原蟲的已有研究,而且局限于對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)或單因素的研究,缺乏系統(tǒng)性和針對(duì)性。雞球蟲無法有效的進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)是制約其機(jī)制深入研究的瓶頸,且細(xì)胞培養(yǎng)條件缺乏標(biāo)準(zhǔn),存在入侵及發(fā)育的不規(guī)律性。盡管如此,雞球蟲的細(xì)胞培養(yǎng)目前仍是研究球蟲入侵機(jī)制及其與宿主互作的有效平臺(tái)。為從整體水平系統(tǒng)分析雞球蟲在入侵宿主細(xì)胞過程中球蟲和宿主細(xì)胞的關(guān)鍵基因或關(guān)鍵蛋白,本研究以柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)為研究對(duì)象,以DF1細(xì)胞為宿主細(xì)胞,通過建立E.tenella體外入侵細(xì)胞模型,運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)RNA-seq和蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)分別對(duì)入侵模型中DF1細(xì)胞和E.tenella子孢子的關(guān)鍵基因及關(guān)鍵蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)篩選鑒定,并對(duì)2個(gè)E.tenella候選關(guān)鍵蛋白U6KIV9和H9B954的功能進(jìn)行了初步研究。為雞球蟲的入侵機(jī)制以及與宿主的相互作用研究提供了思路與數(shù)據(jù)參考,并為雞球蟲病的防控提供借鑒。研究?jī)?nèi)容具體包括以下5部分:1.體外E.tenella入侵DF1細(xì)胞模型的建立本研究以DF1細(xì)胞為E.tenella的宿主細(xì)胞,將E.tenella子孢子接種細(xì)胞觀察其對(duì)細(xì)胞的入侵及發(fā)育情況,并分別統(tǒng)計(jì)不同接種時(shí)間和接種劑量對(duì)入侵率的影響,確定最佳接種時(shí)間和接種劑量,建立E.tenella對(duì)DF1細(xì)胞的入侵模型。結(jié)果顯示,E.tenella子孢子可成功入侵DF1細(xì)胞,并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行第一代裂殖體和裂殖子的發(fā)育;子孢子對(duì)DF1細(xì)胞的入侵率隨時(shí)間遞增,2 h內(nèi)遞增程度最強(qiáng),2 h后明顯減弱,在2 h時(shí)入侵率為33.14%;子孢子接種劑量與入侵率密切相關(guān),當(dāng)劑量小于5×10~5時(shí),入侵率與接種劑量呈正相關(guān),高于5×10~5時(shí)入侵率隨接種劑量增加而下降,當(dāng)接種劑量為5×10~5時(shí),入侵率為35.7%。結(jié)果表明,成功建立了E.tenella入侵DF1細(xì)胞模型,2 h為最佳接種時(shí)間點(diǎn),5×10~5個(gè)子孢子接種2.5×10~5個(gè)細(xì)胞為最佳接種比例。2.入侵模型中宿主細(xì)胞DF1的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析為系統(tǒng)篩選宿主細(xì)胞在E.tenella入侵過程中的關(guān)鍵作用基因,本研究以未接種E.tenella的DF1細(xì)胞為對(duì)照,通過RNA-seq技術(shù)對(duì)E.tenella入侵模型中宿主細(xì)胞DF1的m RNA進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果顯示,共鑒定到DF1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄基因個(gè)數(shù)為5744,其中35個(gè)為顯著調(diào)節(jié)基因,上調(diào)基因32個(gè),下調(diào)基因3個(gè)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,差異基因全部富集到細(xì)胞核和轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物中,具有轉(zhuǎn)錄因子活性及序列特異DNA分子結(jié)合等功能,參與RNA以及核酸堿基的生物合成和RNA聚合酶II啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),在MAPK信號(hào)通路中的富集程度最高。熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果的符合率高達(dá)87.5%(7/8),其中差異基因Fos B、NR4A3和NR4A1在E.tenella感染后的DF1和CEF細(xì)胞均發(fā)生極顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄(P0.01),在E.tenella感染后2 h、4 h和8h的DF1細(xì)胞中均呈現(xiàn)高水平轉(zhuǎn)錄(P0.05)。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選的35個(gè)差異顯著基因可作為宿主細(xì)胞在E.tenella入侵過程中的候選關(guān)鍵基因,其中Fos B、NR4A3和NR4A1為重要候選關(guān)鍵基因。3.入侵模型中DF1細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析為從蛋白水平整體分析E.tenella入侵過程宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白,本研究以未接種E.tenella的DF1細(xì)胞為對(duì)照,通過iTRAQ技術(shù)對(duì)E.tenella入侵模型中宿主細(xì)胞DF1的蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)學(xué)分析。結(jié)果顯示,共鑒定到DF1細(xì)胞的有效蛋白3291個(gè),顯著調(diào)節(jié)蛋白302個(gè),其中上調(diào)蛋白110個(gè),下調(diào)蛋白192個(gè)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,差異顯著蛋白主要定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及線粒體,具有核酸結(jié)合、基因表達(dá)、RNA加工及代謝功能,結(jié)構(gòu)域主要富集到RNA識(shí)別和核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。上調(diào)蛋白在氨酰生物合成、內(nèi)吞及吞噬體信號(hào)通路中有明顯富集,下調(diào)蛋白主要富集到剪接體信號(hào)通路中。4.入侵模型中E.tenella子孢子的蛋白質(zhì)組學(xué)分析為從系統(tǒng)分析E.tenella入侵宿主細(xì)胞過程中E.tenella的關(guān)鍵蛋白,本研究以未接種細(xì)胞的E.tenella子孢子為對(duì)照,通過iTRAQ技術(shù)對(duì)E.tenella入侵模型中E.tenella子孢子的蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)學(xué)分析。結(jié)果顯示,共鑒定到E.tenella的有效蛋白841個(gè),顯著調(diào)節(jié)蛋白81個(gè),其中上調(diào)蛋白40個(gè),下調(diào)蛋白41個(gè)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,顯著差異蛋白主要是以小核糖體亞群為主要組分的細(xì)胞器和超分子復(fù)合物,定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞外以及細(xì)胞膜中,具有結(jié)合和催化功能,蛋白結(jié)構(gòu)域富集在具有類似PH結(jié)構(gòu)域和吡哆醛磷酸依賴型轉(zhuǎn)移酶主要部位的2型亞結(jié)構(gòu)域。5.E.tenella蛋白U6KIV9和H9B954的功能研究本研究選取了蛋白質(zhì)組學(xué)篩選到的2個(gè)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最高的E.tenella分泌蛋白U6KIV9和H9B954進(jìn)行功能的初步研究,包括生物信息學(xué)分析、基因的克隆表達(dá)、多克隆抗體的制備、細(xì)胞黏附作用、細(xì)胞入侵作用及動(dòng)物免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)。生物信息分析結(jié)果顯示,蛋白U6KIV9同時(shí)存在信號(hào)肽和跨膜區(qū),不存在已知保守結(jié)構(gòu)域,蛋白H9B954存在信號(hào)肽,具有MAR_sialic_bdg結(jié)構(gòu)域。對(duì)蛋白的基因進(jìn)行了成功克隆及蛋白表達(dá),并制備了相應(yīng)的多克隆抗體。通過建立酵母菌表面展示蛋白黏附試驗(yàn)?zāi)Ｐ?分別對(duì)蛋白U6KIV9和H9B954的細(xì)胞黏附作用進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,表面展示有蛋白U6KIV9或H9B954的酵母菌EBY100對(duì)DF1細(xì)胞均有明顯的黏附作用(P0.05),且蛋白H9B954的黏附作用略高于U6KIV9(P0.05)。通過制備的多克隆抗體對(duì)蛋白進(jìn)行阻斷研究其對(duì)細(xì)胞的入侵作用,結(jié)果顯示,蛋白U6KIV9和H9B954的多克隆抗體均可明顯抑制E.tenella子孢子對(duì)DF1細(xì)胞的入侵(P0.05),抑制率分別高達(dá)33.0±3.13和31.0±4.52;動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,免疫蛋白U6KIV9或H9B954可明顯改善E.tenella感染造成的雞體重增長(zhǎng)緩慢(P0.05),顯著降低卵囊排出量(P0.05),2株蛋白無明顯差異。結(jié)果表明,E.tenella蛋白U6KIV9和H9B954對(duì)宿主細(xì)胞均具有黏附和入侵作用,并具有部分免疫保護(hù)力。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.723

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本文編號(hào)：2657091