發(fā)布時間：2020-05-10 09:26

【摘要】：由一種或多種艾美耳球蟲引起的雞球蟲病是危害養(yǎng)雞業(yè)最嚴重的寄生蟲病,每年可造成世界范圍內(nèi)高達30億美元的經(jīng)濟損失。對雞球蟲病的有效防控,取決于對球蟲入侵、寄生及致病機制的充分了解。其中,雞球蟲對宿主細胞的入侵是建立感染的第一步,也是進行球蟲病防控的最佳時期。目前對于雞球蟲入侵機制及其與宿主相互作用的了解,大多間接來源于弓形蟲和瘧原蟲的已有研究,而且局限于對單個蛋白質(zhì)或單因素的研究,缺乏系統(tǒng)性和針對性。雞球蟲無法有效的進行體外細胞培養(yǎng)是制約其機制深入研究的瓶頸,且細胞培養(yǎng)條件缺乏標準,存在入侵及發(fā)育的不規(guī)律性。盡管如此,雞球蟲的細胞培養(yǎng)目前仍是研究球蟲入侵機制及其與宿主互作的有效平臺。為從整體水平系統(tǒng)分析雞球蟲在入侵宿主細胞過程中球蟲和宿主細胞的關(guān)鍵基因或關(guān)鍵蛋白,本研究以柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)為研究對象,以DF1細胞為宿主細胞,通過建立E.tenella體外入侵細胞模型,運用轉(zhuǎn)錄組學RNA-seq和蛋白質(zhì)組學iTRAQ技術(shù)分別對入侵模型中DF1細胞和E.tenella子孢子的關(guān)鍵基因及關(guān)鍵蛋白質(zhì)進行系統(tǒng)篩選鑒定,并對2個E.tenella候選關(guān)鍵蛋白U6KIV9和H9B954的功能進行了初步研究。為雞球蟲的入侵機制以及與宿主的相互作用研究提供了思路與數(shù)據(jù)參考,并為雞球蟲病的防控提供借鑒。研究內(nèi)容具體包括以下5部分:1.體外E.tenella入侵DF1細胞模型的建立本研究以DF1細胞為E.tenella的宿主細胞,將E.tenella子孢子接種細胞觀察其對細胞的入侵及發(fā)育情況,并分別統(tǒng)計不同接種時間和接種劑量對入侵率的影響,確定最佳接種時間和接種劑量,建立E.tenella對DF1細胞的入侵模型。結(jié)果顯示,E.tenella子孢子可成功入侵DF1細胞,并在細胞內(nèi)進行第一代裂殖體和裂殖子的發(fā)育;子孢子對DF1細胞的入侵率隨時間遞增,2 h內(nèi)遞增程度最強,2 h后明顯減弱,在2 h時入侵率為33.14%;子孢子接種劑量與入侵率密切相關(guān),當劑量小于5×10~5時,入侵率與接種劑量呈正相關(guān),高于5×10~5時入侵率隨接種劑量增加而下降,當接種劑量為5×10~5時,入侵率為35.7%。結(jié)果表明,成功建立了E.tenella入侵DF1細胞模型,2 h為最佳接種時間點,5×10~5個子孢子接種2.5×10~5個細胞為最佳接種比例。2.入侵模型中宿主細胞DF1的轉(zhuǎn)錄組學分析為系統(tǒng)篩選宿主細胞在E.tenella入侵過程中的關(guān)鍵作用基因,本研究以未接種E.tenella的DF1細胞為對照,通過RNA-seq技術(shù)對E.tenella入侵模型中宿主細胞DF1的m RNA進行比較轉(zhuǎn)錄組學分析。結(jié)果顯示,共鑒定到DF1細胞的轉(zhuǎn)錄基因個數(shù)為5744,其中35個為顯著調(diào)節(jié)基因,上調(diào)基因32個,下調(diào)基因3個。生物信息學分析結(jié)果顯示,差異基因全部富集到細胞核和轉(zhuǎn)錄因子復合物中,具有轉(zhuǎn)錄因子活性及序列特異DNA分子結(jié)合等功能,參與RNA以及核酸堿基的生物合成和RNA聚合酶II啟動的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),在MAPK信號通路中的富集程度最高。熒光定量PCR驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學結(jié)果的符合率高達87.5%(7/8),其中差異基因Fos B、NR4A3和NR4A1在E.tenella感染后的DF1和CEF細胞均發(fā)生極顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄(P0.01),在E.tenella感染后2 h、4 h和8h的DF1細胞中均呈現(xiàn)高水平轉(zhuǎn)錄(P0.05)。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)錄組學篩選的35個差異顯著基因可作為宿主細胞在E.tenella入侵過程中的候選關(guān)鍵基因,其中Fos B、NR4A3和NR4A1為重要候選關(guān)鍵基因。3.入侵模型中DF1細胞的蛋白質(zhì)組學分析為從蛋白水平整體分析E.tenella入侵過程宿主細胞的關(guān)鍵蛋白,本研究以未接種E.tenella的DF1細胞為對照,通過iTRAQ技術(shù)對E.tenella入侵模型中宿主細胞DF1的蛋白進行比較蛋白質(zhì)學分析。結(jié)果顯示,共鑒定到DF1細胞的有效蛋白3291個,顯著調(diào)節(jié)蛋白302個,其中上調(diào)蛋白110個,下調(diào)蛋白192個。生物信息學分析結(jié)果顯示,差異顯著蛋白主要定位于細胞核、細胞質(zhì)及線粒體,具有核酸結(jié)合、基因表達、RNA加工及代謝功能,結(jié)構(gòu)域主要富集到RNA識別和核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。上調(diào)蛋白在氨酰生物合成、內(nèi)吞及吞噬體信號通路中有明顯富集,下調(diào)蛋白主要富集到剪接體信號通路中。4.入侵模型中E.tenella子孢子的蛋白質(zhì)組學分析為從系統(tǒng)分析E.tenella入侵宿主細胞過程中E.tenella的關(guān)鍵蛋白,本研究以未接種細胞的E.tenella子孢子為對照,通過iTRAQ技術(shù)對E.tenella入侵模型中E.tenella子孢子的蛋白進行比較蛋白質(zhì)學分析。結(jié)果顯示,共鑒定到E.tenella的有效蛋白841個,顯著調(diào)節(jié)蛋白81個,其中上調(diào)蛋白40個,下調(diào)蛋白41個。生物信息學分析結(jié)果顯示,顯著差異蛋白主要是以小核糖體亞群為主要組分的細胞器和超分子復合物,定位于細胞質(zhì)、細胞核、細胞外以及細胞膜中,具有結(jié)合和催化功能,蛋白結(jié)構(gòu)域富集在具有類似PH結(jié)構(gòu)域和吡哆醛磷酸依賴型轉(zhuǎn)移酶主要部位的2型亞結(jié)構(gòu)域。5.E.tenella蛋白U6KIV9和H9B954的功能研究本研究選取了蛋白質(zhì)組學篩選到的2個上調(diào)表達倍數(shù)最高的E.tenella分泌蛋白U6KIV9和H9B954進行功能的初步研究,包括生物信息學分析、基因的克隆表達、多克隆抗體的制備、細胞黏附作用、細胞入侵作用及動物免疫保護效果的評價。生物信息分析結(jié)果顯示,蛋白U6KIV9同時存在信號肽和跨膜區(qū),不存在已知保守結(jié)構(gòu)域,蛋白H9B954存在信號肽,具有MAR_sialic_bdg結(jié)構(gòu)域。對蛋白的基因進行了成功克隆及蛋白表達,并制備了相應(yīng)的多克隆抗體。通過建立酵母菌表面展示蛋白黏附試驗模型,分別對蛋白U6KIV9和H9B954的細胞黏附作用進行研究,結(jié)果顯示,表面展示有蛋白U6KIV9或H9B954的酵母菌EBY100對DF1細胞均有明顯的黏附作用(P0.05),且蛋白H9B954的黏附作用略高于U6KIV9(P0.05)。通過制備的多克隆抗體對蛋白進行阻斷研究其對細胞的入侵作用,結(jié)果顯示,蛋白U6KIV9和H9B954的多克隆抗體均可明顯抑制E.tenella子孢子對DF1細胞的入侵(P0.05),抑制率分別高達33.0±3.13和31.0±4.52;動物免疫保護實驗結(jié)果顯示,免疫蛋白U6KIV9或H9B954可明顯改善E.tenella感染造成的雞體重增長緩慢(P0.05),顯著降低卵囊排出量(P0.05),2株蛋白無明顯差異。結(jié)果表明,E.tenella蛋白U6KIV9和H9B954對宿主細胞均具有黏附和入侵作用,并具有部分免疫保護力。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.723

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