【摘要】：肌肉組織是動物機體的重要組成部分,肌肉生長速度和肌肉量是動物生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟性狀之一。肌肉生長發(fā)育是一個復(fù)雜的過程,受到多種轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳等因素的調(diào)控,因此解析肌肉生長發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要的理論和應(yīng)用價值。LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt,沒有蛋白編碼能力的RNA,在多種生物學(xué)過程中具有重要的作用,盡管目前已發(fā)現(xiàn)了很多在肌肉組織中表達的lncRNA,但絕大多數(shù)lncRNA的功能和調(diào)控機制并不清楚。本實驗室前期通過分析C2C12成肌細(xì)胞不同分化時期lncRNA的表達水平變化,發(fā)現(xiàn)了一個lncRNA-AK004418隨著細(xì)胞分化表達水平持續(xù)升高;該lncRNA位于SYNPO2基因內(nèi)含子,因此將其命名為SYISL(SYNPO2 intron sense-overlapping lncRNA)。本研究通過基因敲除小鼠模型研究和細(xì)胞實驗,開展了lncRNA SYISL對肌肉生長發(fā)育的影響及其表觀調(diào)控機制研究。具體研究結(jié)果如下:1.利用熒光定量PCR技術(shù)驗證了SYISL基因隨著C2C12細(xì)胞的分化表達水平顯著增加,組織表達譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在腿肌、背最長肌和舌等肌肉組織中高豐度表達。利用啟動子雙熒光報告載體試驗和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin immunoprecitation,ChIP)發(fā)現(xiàn)了MyoD可影響SYISL基因表達,并且SYISL啟動子-200bp到+200bp區(qū)域存在MyoD結(jié)合位點,表明SYISL基因是受MyoD調(diào)控的靶基因。2.利用CRISPR-Cas9技術(shù)制備了雜合型SYISL基因敲除小鼠,以此為基礎(chǔ)進行雜交擴繁,獲得了SYISL雙等位基因敲除(SYISL KO)小鼠,發(fā)現(xiàn)WT小鼠和SYISL KO小鼠的體重和生長速度并無顯著差異。但與WT小鼠相比,SYISL KO小鼠脛骨前肌、股四頭肌和腓腸肌等肌肉重量和肌纖維密度顯著增加,肌纖維面積減少。分離培養(yǎng)了SYISL KO小鼠和WT小鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞,檢測了SYISL基因敲除對肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖能力和分化的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SYISL基因敲除可以顯著減少肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和融合能力,但可顯著促進肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化。3.通過RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)和RNA pulldown實驗發(fā)現(xiàn)SYISL可以與EZH2(Enhancer of Zeste Homology 2)蛋白結(jié)合;通過構(gòu)建SYISL基因缺失片段進行RNA pulldown和超表達實驗,發(fā)現(xiàn)SYISL全長轉(zhuǎn)錄本是其結(jié)合EZH2和發(fā)揮功能所必需的。ChIP和共轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)SYISL可通過招募PRC2(Polycomb Repressive Complex 2)蛋白導(dǎo)致靶基因啟動子區(qū)域組蛋白H3第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化(H3K27me3),從而抑制靶基因表達;其中促進細(xì)胞增殖主要是通過抑制細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子p21基因的表達,而抑制細(xì)胞分化則主要是通過降低MyoG、Myh4和MCK等肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達。4.利用Chromatin isolation by RNA purification(ChIRP)技術(shù)發(fā)現(xiàn)SYISL可直接結(jié)合在靶基因MyoG、Myh4、MCK和p21基因的啟動子區(qū)域;在分別來源于WT和SYISL KO小鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞中分別超表達EZH2,發(fā)現(xiàn)僅在WT肌衛(wèi)星細(xì)胞中EZH2可以抑制下游靶基因表達,而在SYISL KO肌衛(wèi)星細(xì)胞中無顯著影響,表明SYISL基因是PRC2調(diào)節(jié)成肌過程所必需的。5.通過保守性分析發(fā)現(xiàn)在豬基因組中SYNPO2基因的第1內(nèi)含子處存在一個lncRNA AK238214。利用RACE技術(shù)驗證了該lncRNA全長1472bp。時空表達分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該lncRNA在豬肌肉中高表達,并隨著肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化表達水平持續(xù)升高。核質(zhì)定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)AK238214主要位于豬肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。設(shè)計AK238214特異siRNA干擾片段進行慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染豬肌衛(wèi)星細(xì)胞,檢測了豬肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化能力,發(fā)現(xiàn)干擾AK238214可以抑制細(xì)胞增殖,促進豬肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化,這一結(jié)果與在小鼠中的研究結(jié)果一致。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了lncRNA SYISL可通過與PRC2蛋白互作抑制肌細(xì)胞分化和降低肌肉重量,并在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中驗證了豬SYISL對肌細(xì)胞增殖與分化的影響。該研究結(jié)果為動物肌肉生長發(fā)育研究提供了新的調(diào)節(jié)因子和表觀調(diào)控機制,對深入解析肌肉生長發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。
【圖文】：

長發(fā)育及調(diào)控生長發(fā)育骼肌主要附著于骨骼上，其通過肌纖維的收縮來完長發(fā)育是動物產(chǎn)肉性能和肉質(zhì)性狀的主要重要影響發(fā)育形成原腸胚，并形成外胚層、中胚層和內(nèi)胚層（Chordamesoderm）、軸旁中胚層（Paraxial meso mesoderm）和側(cè)中胚層（Lateral mesoderm）(Gilb發(fā)育，軸旁中胚層可分化形成生肌節(jié)，生肌節(jié)可形遷移到四肢和軀干部分，，同時，在 系列因子或者細(xì)胞（Myoblasts）(Musumeci et al 2015)。成肌細(xì)胞后形成成熟的肌纖維 (圖 1-1)。

圖 1-2 Pax3/Pax7 調(diào)節(jié)肌祖細(xì)胞模式圖(BuckinghamandRigby 2014)Figure 1-2 The Pax3/Pax7 involved in Progression of Muscle Progenitor Cells Toward Formatioof Differentiated Skeletal Muscle脊椎動物的細(xì)胞增殖主要以有絲分裂的形式進行，從 次有絲分裂結(jié)束到下次有絲分裂結(jié)束則成為 個細(xì)胞周期。細(xì)胞周期的有序進行受到細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDKs）家族，細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）家族和多種信號通路等的調(diào)節(jié)(Nurs2002)。而 p15INK4B、p16INK4A、p18INK4C、p19INK4D、p21Cip1和 p27Kip1等可作為 CDK和 Cyclins 家族基因的抑制因子，導(dǎo)致細(xì)胞周期進程受阻，抑制細(xì)胞增殖(Besson et 2008; MalumbresandBarbacid 2009)。p21 基因在 G1/S checkpoint 中發(fā)揮了重要作用其可以結(jié)合并抑制 CDKs 家族基因（包括 CDK1、CDK2、CDK4 和 CDK6）的表達，從而調(diào)節(jié) G1 期到 S 期的進程(GartelandRadhakrishnan 2005)。最近的研究揭示 p21Cip基因?qū)趋兰〖⌒l(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞的增殖具有重要的作用(Halevy et al 1995WalshandPerlman 1997)，敲除 p21 基因可以促進小鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖(Chinzei et
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.2

【參考文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 夏盼;長非編碼RNA-AK004418對成肌細(xì)胞增殖和分化的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

本文編號：2657039