發(fā)布時間：2020-05-10 08:21

【摘要】：氨基酸作為重要的有機(jī)小分子參與各項(xiàng)生命活動,既可合成蛋白質(zhì)、脂質(zhì),又是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分化、增殖與自噬等細(xì)胞代謝的關(guān)鍵信號分子。氨基酸作為外源信號可以激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,mTOR)等來調(diào)控細(xì)胞代謝。Na~+偶聯(lián)中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(sodium-coupled neutral amino acid transporter 2,SNAT2)是溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可轉(zhuǎn)運(yùn)蛋氨酸(methionine,Met)、亮氨酸(leucine,Leu)等中性氨基酸進(jìn)入細(xì)胞,并在奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)中高表達(dá),促進(jìn)BMECs乳合成,但其具體機(jī)理尚不清楚。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),SNAT2可以介導(dǎo)Met參與調(diào)節(jié)BMECs乳合成,而在泌乳過程中,BMECs的乳合成與細(xì)胞增殖、自噬及凋亡均相關(guān),但其具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本研究將擬揭示Met調(diào)節(jié)BMECs乳脂合成、細(xì)胞增殖及自噬的分子機(jī)理,為進(jìn)一步研究Met在乳生產(chǎn)中的重要作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究以組織塊法培養(yǎng)的BMECs為研究對象,免疫熒光結(jié)合Western blotting來鑒定BMECs中角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)與β-酪蛋白(β-casein)的表達(dá),證明獲得純化、可泌乳的體外培養(yǎng)BMECs。向體外培養(yǎng)的BMECs分別添加0、0.3、0.6、0.9和1.2 mM的Met,BODIPY染色及甘油三酯(triglyceride,TG)檢測發(fā)現(xiàn),隨著Met濃度的增加,BMECs中脂滴及TG含量逐漸增加,并且在Met濃度為0.6 mM時達(dá)到峰值,隨后下降。結(jié)果表明Met以劑量依賴性方式促進(jìn)乳脂肪合成;CASY細(xì)胞計數(shù)及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞周期變化,發(fā)現(xiàn)隨著Met濃度增加,細(xì)胞數(shù)及S期和G2/M期的細(xì)胞比例逐漸增加,并且在Met濃度為0.6 mM時達(dá)到峰值,隨后降低。結(jié)果表明Met以劑量依賴性影響B(tài)MECs增殖及細(xì)胞周期;Western blotting檢測相關(guān)蛋白表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1的蛋白水平顯著增加,在Met濃度為0.6 mM時最高,隨后逐漸下降。結(jié)果說明Met對mTOR,SREBP-1c和Cyclin D1信號傳導(dǎo)途徑的激活也具有劑量依賴性,添加0.6 mM的Met為最適濃度,過量的Met可能具有細(xì)胞毒性。為了研究Met對BMECs自噬的影響,Western blotting檢測SNAT2抑制后自噬標(biāo)志蛋白LC3-I/II表達(dá)量的影響,并利用免疫熒光檢測細(xì)胞自噬斑點(diǎn)(LC3-II)變化。結(jié)果顯示,SNAT2抑制時,p-mTOR表達(dá)量下降,LC3-II表達(dá)量增加,免疫熒光檢測自噬斑點(diǎn)增多。添加自噬增強(qiáng)劑海藻糖(trehalose,Tre)和Met后,Met組同Met+Tre組比較,p-mTOR表達(dá)量增加,LC3-II表達(dá)量降低,自噬斑點(diǎn)減少;添加Tre和Met并抑制SNAT2時,p-mTOR表達(dá)量下降,LC3-II表達(dá)量增多,自噬斑點(diǎn)增多。以上結(jié)果表明Met通過SNAT2抑制自噬。SNAT2基因進(jìn)行過表達(dá)和干擾表明SNAT2可以正向調(diào)節(jié)BMECs中甘油三脂的分泌和脂滴的形成,Western blotting檢測結(jié)果表明SNAT2過表達(dá)可以上調(diào)p-mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1的蛋白水平,而干擾SNAT2后,結(jié)果與過表達(dá)相反。表明SNAT2是mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1的上游信號分子,并可正向調(diào)節(jié)乳脂肪合成和細(xì)胞增殖。為了研究Met調(diào)節(jié)SNAT2表達(dá)的分子機(jī)制,添加PI3K抑制劑-渥曼青霉素(Wortmannin,Wm)抑制PI3K信號通路的同時過表達(dá)SNAT2,Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),PI3K抑制消除了SNAT2過表達(dá)對p-mTOR、SREBP-1c以及Cyclin D1的蛋白質(zhì)水平的刺激。PI3K抑制實(shí)驗(yàn)表明,SNAT2激活mTOR,SREBP-1c和Cyclin D1信號通路需要PI3K激活。添加0.6 mM的Met同時抑制SNAT2,結(jié)果表明SNAT2敲低顯著抑制Met對p-PI3K、p-mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1的蛋白質(zhì)水平的上調(diào)作用。Western blotting結(jié)合qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),0.6 mM Met處理顯著增加BMECs中SNAT2的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)0.6mM Met處理顯著增加SNAT2的細(xì)胞質(zhì)定位。這些數(shù)據(jù)表明,Met通過SNAT2-PI3K調(diào)節(jié)mTOR,SREBP-1c和Cyclin D1信號通路。綜上所述,Met劑量依賴性調(diào)節(jié)mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1的表達(dá),過量的Met對細(xì)胞具有毒性,Met通過SNAT2-PI3K途徑調(diào)節(jié)mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1信號通路,從而影響B(tài)MECs乳脂肪合成、細(xì)胞增殖與自噬。
【圖文】：

1圖 1-1 泌乳期的腺泡與腺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖[3] Architecture diagram of lactating mammary alveolus and alveolar epithelial 的各種營養(yǎng)物質(zhì)供腺泡的分泌細(xì)胞產(chǎn)生乳汁并將其分泌到腺泡腔中，這一泌；而乳汁匯集后由導(dǎo)管排出則稱為排乳，乳汁的分泌和排乳合稱為泌乳由腺泡的數(shù)目決定，腺泡多則泌乳能力強(qiáng)[4]。泌乳主要通過神經(jīng)-激素途動及維持兩過程。泌乳啟動首先于妊娠后期合成酪蛋白和乳糖等成分，然大量分泌乳汁[5,6]。泌乳維持指的是在泌乳啟動后較長的一段時間內(nèi)仍持肪的合成代謝是牛奶的重要組成，主要由 95%甘油三酯（triglyceride，TG）、2%的甘油小于 0.5%的膽固醇以及少量的游離脂肪酸組成[8]。乳脂肪也是評估牛奶標(biāo)，每 100 g 牛奶約含 3-4 g 的乳脂。牛奶中大于一半的脂肪酸（fatty ac酸（saturated fatty acid，SFA），每 100 g 牛奶約含 1.9 g，其中 60%左右牛奶中含量最高的單不飽和脂肪酸（mono-unsaturated fatty acid，MUFA）

3圖 1-2 奶牛乳腺中脂肪酸合成代謝途徑[14]Fig.1-2 Metabolic pathways of fatty acids synthesis in bovine mammary glan油三酯的合成酯是乳脂肪的主要組成成分，其合成場所為乳腺上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。來源攝取和硬脂酰輔酶 A 去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）去飽和的用后，生成脂酰輔酶 A 參與甘油三酯的合成，并與 3-磷酸甘油酯化。甘油二�；视王；D(zhuǎn)移酶 1（diglyceride acyltransferase，DGAT1）等酶調(diào)控先在甘油主鏈的 sn-1(3)進(jìn)行脂肪酸酯化，再將其合成于 sn-2 處并脫去磷油二酯，，經(jīng) DGAT 催化生成甘油三酯[15]。滴的分泌Lipid droplet）是細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，用于以中性脂質(zhì)如甘油三酯和甾醇酯的形肪最終以脂滴的形式分泌，其大小為 40 nm-100 μm 不等。脂滴是包含許多脂質(zhì)單層構(gòu)成的中性脂質(zhì)核心，其中一些蛋白質(zhì)可參與脂質(zhì)代謝[16,17在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中合成中性脂質(zhì)導(dǎo)致新脂滴的形成，其可形成為與部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823

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本文編號：2657022