【摘要】：本文旨在研究黃體期短期優(yōu)飼對綿羊卵泡發(fā)育的影響及其調控機理。通過短期優(yōu)飼對血漿和卵泡液中代謝信號物質、生殖激素濃度、血漿脂質代謝及卵泡顆粒細胞生殖相關基因表達影響,探討短期優(yōu)飼促卵泡發(fā)育的作用機理,并通過下丘腦-垂體-卵巢軸系轉錄組分析,揭示短期優(yōu)飼影響卵泡發(fā)育的分子調控網(wǎng)絡,為研究營養(yǎng)調控綿羊繁殖提供理論依據(jù)。試驗包含4部分內(nèi)容:1綿羊黃體期短期優(yōu)飼時間的確定試驗選取60只9-10月齡、體重40 kg左右的道寒雜交(道賽特公羊×小尾寒羊母羊)一代母羊,隨機分為四組,15只/組。對照組試驗期間飼喂基礎日糧(DE 11.72 MJ/d,DP 79.71 g/d),試驗組先飼喂基礎日糧,在優(yōu)飼期間飼喂試驗日糧(DE 18.75 MJ/d,DP 108.44 g/d),優(yōu)飼結束后恢復基礎日糧。所有試驗用羊進行同期發(fā)情處理(陰道埋置CIDR 12 d,肌注PG 0.1 mg兩次),以埋栓日為第0 d,試驗組于埋栓的第2 d、6d、8 d分別飼喂試驗日糧,優(yōu)飼期分別為10 d、6 d、4 d,于埋栓第12 d優(yōu)飼結束撤栓注射PG,于埋栓后第20 d,選擇發(fā)情結束的羊,利用腹腔鏡來檢測黃體個數(shù)。記錄補飼前、補飼后體重變化及排卵率,確定促排的最佳優(yōu)飼時間。結果表明:試驗組平均體重增加但無顯著差異(P0.05);與對照組相比,優(yōu)飼10 d、6 d、4 d排卵率分別提高了75%,25%,0%。由此確定,發(fā)情前10 d進行短期優(yōu)飼,可作為后續(xù)優(yōu)飼試驗方案進行。2黃體期短期優(yōu)飼對綿羊卵泡發(fā)育及血漿相關指標的影響選擇60只體重40 kg左右的道寒雜交羊,隨機分為試驗組和對照組,每組30只。按短期優(yōu)飼10 d方案進行。優(yōu)飼第1、2、4、6、8、10 d每組隨機選取5只羊,空腹頸靜脈采血,收集血漿,備測生殖激素、代謝激素、脂質代謝。于埋栓后第13 d,14d,15 d,每組隨機選取6只羊屠宰,取卵巢組織,按小卵泡(≤3.0 mm),中等卵泡(3.0-5.0 mm)和大卵泡(≥5.0 mm)分別收集卵泡液及顆粒細胞,備測生殖激素、代謝激素及基因的表達。結果表明:短期優(yōu)飼組小卵泡(3.0 mm)數(shù)量極顯著低于對照組;中等卵泡(3.0-5.0 mm)數(shù)量呈極顯著上升;大卵泡(≥5.0 mm)數(shù)量在卵泡期后期呈極顯著上升。中等卵泡和大卵泡中葡萄糖、胰島素含量極顯著升高,瘦素含量只在大卵泡中顯著升高。而小卵泡液中FSH含量顯著增加,LH含量大卵泡中極顯著的增加,雌二醇(E_2)濃度在大卵泡中極顯著的高于小卵泡、中等卵泡。血漿中葡萄糖、胰島素和瘦素濃度顯著升高,生殖激素在短期優(yōu)飼期間,FSH、LH和雌激素平均水平差異不顯著。血漿中膽固醇、游離脂肪酸濃度全期顯著下降,高密度脂蛋白膽固醇濃度極顯著增加,尿素氮濃度顯著下降。表明黃體期短期優(yōu)飼,有利于促進體內(nèi)能量的正平衡,提高葡萄糖、胰島素和瘦素的利用率和進入率,促進卵泡顆粒細胞的增殖分化速度。3黃體期短期優(yōu)飼對綿羊卵泡顆粒細胞相關基因表達的影響取埋栓后第13 d,14 d,15 d屠宰的6只發(fā)情羊卵巢上分離得到小卵泡(≤3.0mm),中等卵泡(3.0-5.0 mm)和大卵泡(≥5.0 mm)的顆粒細胞進行qRT-PCR檢測。結果表明:黃體期短期優(yōu)飼促進卵巢FSHR1和FSHR3 mRNA基因在小卵泡和中等卵泡中的極顯著表達,各級卵泡中CYP17A1mRNA基因表達顯著高表達(P0.01),STAR和CYP19A1 mRNA基因在大卵泡中高表達(P0.01),同時LHR和ESR1的表達量極顯著增加。中等卵泡和大卵泡中OB-R和IGF-1 mRNA基因在顆粒細胞中的表達極顯著增加。表明黃體期短期優(yōu)飼可通過調控顆粒細胞中FSHR不同剪接及類固醇調節(jié)基因的表達,且卵泡內(nèi)旁分泌或自分泌因子基因的表達,從而調控卵泡發(fā)育。4黃體期短期優(yōu)飼對綿羊下丘腦-垂體-卵巢軸系轉錄組分析于埋栓后第13 d,14 d,15 d(即卵泡期前期、卵泡期中期、卵泡期后期)每組取3只發(fā)情羊的下丘腦(B)、垂體(P)、卵巢(O)組織,進行RNA-Seq測序。通過Illumina Hiseq 4000測序方法,分析發(fā)情初期、中期、末期對照組與試驗組下丘腦、垂體、卵巢組織中差異表達基因,來探討營養(yǎng)對下丘腦-垂體-卵巢軸系調控卵泡發(fā)育的作用機理。結果表明:共構建了18個RNA文庫,總共獲得33149868-57138286不等的reads,比對到參考基因組上29560138~52705150個reads,占總讀數(shù)的89.17%~94.53%。共檢測出54339個轉錄本,其中獲得了19207個可匹配的表達基因,其中大于2000 bp的轉錄本占編碼轉錄本的64.89%,為后續(xù)基因分析提供了充足的數(shù)據(jù)。卵泡期間,黃體期短期優(yōu)飼可通過鈣離子信號、MAPK信號通路、胰島素信號通路、孕酮介導的卵母細胞成熟等信號通路在下丘腦-垂體-卵巢軸系水平上調控卵泡發(fā)育,使更多的卵泡優(yōu)勢化并發(fā)育成熟;通過下丘腦-垂體-卵巢性腺軸系對各組織3 d共同表達的差異基因分析,篩選出一些與繁殖相關的基因如AGRP、LEPR、PRL、RERG、AKR1D1、IGF1、NLRP14、PRR11、EGR1等基因被顯著富集,所有差異表達的基因均可能作為繁殖的候選基因,參與營養(yǎng)調控卵泡發(fā)育過程。
【圖文】：

波內(nèi)不同卵泡對垂體分泌的 FSH 和 LH 反應性決定[14]。在最后的卵泡波中，F(xiàn)SH 濃度在達到峰值后第 2 d 下降至最低點，F(xiàn)SH 峰后濃度水平的快速下降與卵泡的選擇時間一致[12]，F(xiàn)SH 濃度降低，使一些卵泡不能獲得繼續(xù)生長的支持，而一些卵泡可以繼續(xù)生長，從而引起優(yōu)勢卵泡與從屬卵泡發(fā)生分化，使優(yōu)勢卵泡發(fā)育至排卵卵泡。當卵泡選擇時，F(xiàn)SH 濃度處于 FSH 波谷的最低點，當注射外源 FSH 時，能夠延長反芻動物的優(yōu)勢卵泡選擇[15]。卵泡選擇的另一個表現(xiàn)就是對 LH 的反應能力的獲得，當FSH 濃度迅速升高時，使一些卵泡具有了對 LH 反應能力，，即使在 FSH 較低濃度時仍可保持良好生長態(tài)勢[16]。另一方面，卵泡一旦被選擇，優(yōu)勢卵泡會顯著增加雌激素和抑制素-A[17]的分泌，并通過負反饋下調 FSH 的分泌（圖 1-1[18]），而其他卵泡所分泌的抑制素-B，可調控FSH 的下降速度，如果 FSH 下降速度過快，雖 LH 脈沖存在，僅有 50%的優(yōu)勢卵泡獲得發(fā)育，且母羊的排卵率顯著降低，若 FSH 逐漸下降而 LH 脈沖存在的條件下，綿羊全部排卵且排卵率在正常范圍內(nèi)[19]。因此，優(yōu)勢卵泡中雌激素和抑制素共同反饋作用于性腺軸系統(tǒng)，抑制 FSH 的分泌，卵泡也由對 FSH 敏感轉變?yōu)閷?LH 敏感，并發(fā)育成優(yōu)勢卵泡，此過程是卵泡選擇優(yōu)勢化的重要環(huán)節(jié)。

然而 VL KOVá（2014）報道，短期補飼羽扇豆，對 IGF-1 濃度顯著降低雌激素濃度，顯著增加 3-5 mm 卵泡的數(shù)量。Meza-Herrera（進行短期蛋白補飼，血漿中 IGF-1 濃度、黃體數(shù)量和卵巢激素影響不發(fā)情前補飼蛋氨酸可顯著增加血漿中 IGF-1 濃度，同時增加產(chǎn)仔總數(shù)]。體外培養(yǎng)卵泡時，卵泡內(nèi)注射 IGF-1，可促進從屬卵泡轉變成優(yōu)勢F-1 可提高依賴 FSH 的顆粒細胞分化，尤其是對 LH 受體的接受性[3加 2-脫氧葡萄糖（DOG）和 3-O-甲基葡萄糖（OMG）升高，來調控性，尤其提高葡萄糖的利用率[86]。養(yǎng)調控卵泡發(fā)育的信號系統(tǒng)上研究，葡萄糖濃度升高可促進 GnRH 的脈沖釋放，緩解能量負平衡制作用[87]，同時血糖濃度升高，也會刺激胰島素和瘦素分泌，進而增及瘦素的濃度[88]。胰島素也可在下丘腦水平上顯著增加 GnRH 基因可增強胰島素作用[89]，促進 GnRH 的分泌，降低卵泡閉鎖。而在能中 IGF-1 可調控卵泡分裂和卵泡生長[90]，因此，在綿羊營養(yǎng)促進卵泡萄糖-胰島素系統(tǒng)、瘦素系統(tǒng)和 IGF 系統(tǒng)[91]（圖 1-2）。
【學位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S826

【參考文獻】

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1 陳德權;黃俊琴;衣雪潔;張東軍;;c-fos在卵泡刺激素生成中的作用及信號轉導通路[J];生理科學進展;2015年06期

2 楊光平;張心悅;時蘭英;蘇友強;;ICR小鼠卵母細胞通過旁分泌機制促進排卵關鍵過程[J];南京醫(yī)科大學學報(自然科學版);2015年08期

3 馬會明;黑常春;張永芳;蒲靜;于佳;孫苗;張寧;曹秀琴;馮秀珍;馬苗苗;裴秀英;王燕蓉;;EGF通過PI3K/AKT通路介導小鼠卵巢顆粒細胞增殖[J];寧夏醫(yī)科大學學報;2014年05期

4 張春冬;王義濤;張瑩;李軼;朱慧芳;蔡偉;朱遠遠;卜友泉;;抑制PRR11基因表達對H1299細胞周期的影響[J];中國細胞生物學學報;2013年08期

5 吳艷青;陳麗云;黃曉紅;王正朝;;HIF-NOS信號通路對哺乳動物卵巢NO依賴性功能的調控作用[J];中國生物化學與分子生物學報;2012年04期

6 畢媛;高磊;田琳;于康;鄒淑花;;卵泡液中雌孕激素水平及卵泡大小與卵母細胞成熟度的關系[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展;2011年12期

7 倪和民;張鴻波;劉云海;鄧桂馨;蘆天罡;郭勇;;3個品種綿羊超數(shù)排卵處理后卵巢上促黃體素受體表達差異的研究[J];畜牧獸醫(yī)學報;2011年11期

8 張艷芳;韓玉];;多囊卵巢綜合征胰島素抵抗與信號通路缺陷[J];國際生殖健康/計劃生育雜志;2010年04期

9 張文龍;邢福姍;王韋華;;Ghrelin對奶山羊下丘腦神經(jīng)肽Y(NPY)和刺鼠相關蛋白(AGRP)mRNA表達的影響[J];西北農(nóng)業(yè)學報;2010年01期

10 王延忠;吳德;徐盛玉;周東勝;周平;譚現(xiàn)義;;能量水平和來源對后備母豬卵母細胞質量及相關基因表達的影響[J];畜牧獸醫(yī)學報;2008年12期

本文編號：2657013