【摘要】：本文旨在研究黃體期短期優(yōu)飼對(duì)綿羊卵泡發(fā)育的影響及其調(diào)控機(jī)理。通過(guò)短期優(yōu)飼對(duì)血漿和卵泡液中代謝信號(hào)物質(zhì)、生殖激素濃度、血漿脂質(zhì)代謝及卵泡顆粒細(xì)胞生殖相關(guān)基因表達(dá)影響,探討短期優(yōu)飼促卵泡發(fā)育的作用機(jī)理,并通過(guò)下丘腦-垂體-卵巢軸系轉(zhuǎn)錄組分析,揭示短期優(yōu)飼影響卵泡發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為研究營(yíng)養(yǎng)調(diào)控綿羊繁殖提供理論依據(jù)。試驗(yàn)包含4部分內(nèi)容:1綿羊黃體期短期優(yōu)飼時(shí)間的確定試驗(yàn)選取60只9-10月齡、體重40 kg左右的道寒雜交(道賽特公羊×小尾寒羊母羊)一代母羊,隨機(jī)分為四組,15只/組。對(duì)照組試驗(yàn)期間飼喂基礎(chǔ)日糧(DE 11.72 MJ/d,DP 79.71 g/d),試驗(yàn)組先飼喂基礎(chǔ)日糧,在優(yōu)飼期間飼喂試驗(yàn)日糧(DE 18.75 MJ/d,DP 108.44 g/d),優(yōu)飼結(jié)束后恢復(fù)基礎(chǔ)日糧。所有試驗(yàn)用羊進(jìn)行同期發(fā)情處理(陰道埋置CIDR 12 d,肌注PG 0.1 mg兩次),以埋栓日為第0 d,試驗(yàn)組于埋栓的第2 d、6d、8 d分別飼喂試驗(yàn)日糧,優(yōu)飼期分別為10 d、6 d、4 d,于埋栓第12 d優(yōu)飼結(jié)束撤栓注射PG,于埋栓后第20 d,選擇發(fā)情結(jié)束的羊,利用腹腔鏡來(lái)檢測(cè)黃體個(gè)數(shù)。記錄補(bǔ)飼前、補(bǔ)飼后體重變化及排卵率,確定促排的最佳優(yōu)飼時(shí)間。結(jié)果表明:試驗(yàn)組平均體重增加但無(wú)顯著差異(P0.05);與對(duì)照組相比,優(yōu)飼10 d、6 d、4 d排卵率分別提高了75%,25%,0%。由此確定,發(fā)情前10 d進(jìn)行短期優(yōu)飼,可作為后續(xù)優(yōu)飼試驗(yàn)方案進(jìn)行。2黃體期短期優(yōu)飼對(duì)綿羊卵泡發(fā)育及血漿相關(guān)指標(biāo)的影響選擇60只體重40 kg左右的道寒雜交羊,隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組,每組30只。按短期優(yōu)飼10 d方案進(jìn)行。優(yōu)飼第1、2、4、6、8、10 d每組隨機(jī)選取5只羊,空腹頸靜脈采血,收集血漿,備測(cè)生殖激素、代謝激素、脂質(zhì)代謝。于埋栓后第13 d,14d,15 d,每組隨機(jī)選取6只羊屠宰,取卵巢組織,按小卵泡(≤3.0 mm),中等卵泡(3.0-5.0 mm)和大卵泡(≥5.0 mm)分別收集卵泡液及顆粒細(xì)胞,備測(cè)生殖激素、代謝激素及基因的表達(dá)。結(jié)果表明:短期優(yōu)飼組小卵泡(3.0 mm)數(shù)量極顯著低于對(duì)照組;中等卵泡(3.0-5.0 mm)數(shù)量呈極顯著上升;大卵泡(≥5.0 mm)數(shù)量在卵泡期后期呈極顯著上升。中等卵泡和大卵泡中葡萄糖、胰島素含量極顯著升高,瘦素含量只在大卵泡中顯著升高。而小卵泡液中FSH含量顯著增加,LH含量大卵泡中極顯著的增加,雌二醇(E_2)濃度在大卵泡中極顯著的高于小卵泡、中等卵泡。血漿中葡萄糖、胰島素和瘦素濃度顯著升高,生殖激素在短期優(yōu)飼期間,FSH、LH和雌激素平均水平差異不顯著。血漿中膽固醇、游離脂肪酸濃度全期顯著下降,高密度脂蛋白膽固醇濃度極顯著增加,尿素氮濃度顯著下降。表明黃體期短期優(yōu)飼,有利于促進(jìn)體內(nèi)能量的正平衡,提高葡萄糖、胰島素和瘦素的利用率和進(jìn)入率,促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的增殖分化速度。3黃體期短期優(yōu)飼對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響取埋栓后第13 d,14 d,15 d屠宰的6只發(fā)情羊卵巢上分離得到小卵泡(≤3.0mm),中等卵泡(3.0-5.0 mm)和大卵泡(≥5.0 mm)的顆粒細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明:黃體期短期優(yōu)飼促進(jìn)卵巢FSHR1和FSHR3 mRNA基因在小卵泡和中等卵泡中的極顯著表達(dá),各級(jí)卵泡中CYP17A1mRNA基因表達(dá)顯著高表達(dá)(P0.01),STAR和CYP19A1 mRNA基因在大卵泡中高表達(dá)(P0.01),同時(shí)LHR和ESR1的表達(dá)量極顯著增加。中等卵泡和大卵泡中OB-R和IGF-1 mRNA基因在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)極顯著增加。表明黃體期短期優(yōu)飼可通過(guò)調(diào)控顆粒細(xì)胞中FSHR不同剪接及類(lèi)固醇調(diào)節(jié)基因的表達(dá),且卵泡內(nèi)旁分泌或自分泌因子基因的表達(dá),從而調(diào)控卵泡發(fā)育。4黃體期短期優(yōu)飼對(duì)綿羊下丘腦-垂體-卵巢軸系轉(zhuǎn)錄組分析于埋栓后第13 d,14 d,15 d(即卵泡期前期、卵泡期中期、卵泡期后期)每組取3只發(fā)情羊的下丘腦(B)、垂體(P)、卵巢(O)組織,進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序。通過(guò)Illumina Hiseq 4000測(cè)序方法,分析發(fā)情初期、中期、末期對(duì)照組與試驗(yàn)組下丘腦、垂體、卵巢組織中差異表達(dá)基因,來(lái)探討營(yíng)養(yǎng)對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸系調(diào)控卵泡發(fā)育的作用機(jī)理。結(jié)果表明:共構(gòu)建了18個(gè)RNA文庫(kù),總共獲得33149868-57138286不等的reads,比對(duì)到參考基因組上29560138~52705150個(gè)reads,占總讀數(shù)的89.17%~94.53%。共檢測(cè)出54339個(gè)轉(zhuǎn)錄本,其中獲得了19207個(gè)可匹配的表達(dá)基因,其中大于2000 bp的轉(zhuǎn)錄本占編碼轉(zhuǎn)錄本的64.89%,為后續(xù)基因分析提供了充足的數(shù)據(jù)。卵泡期間,黃體期短期優(yōu)飼可通過(guò)鈣離子信號(hào)、MAPK信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等信號(hào)通路在下丘腦-垂體-卵巢軸系水平上調(diào)控卵泡發(fā)育,使更多的卵泡優(yōu)勢(shì)化并發(fā)育成熟;通過(guò)下丘腦-垂體-卵巢性腺軸系對(duì)各組織3 d共同表達(dá)的差異基因分析,篩選出一些與繁殖相關(guān)的基因如AGRP、LEPR、PRL、RERG、AKR1D1、IGF1、NLRP14、PRR11、EGR1等基因被顯著富集,所有差異表達(dá)的基因均可能作為繁殖的候選基因,參與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控卵泡發(fā)育過(guò)程。
【圖文】：

波內(nèi)不同卵泡對(duì)垂體分泌的 FSH 和 LH 反應(yīng)性決定[14]。在最后的卵泡波中，F(xiàn)SH 濃度在達(dá)到峰值后第 2 d 下降至最低點(diǎn)，F(xiàn)SH 峰后濃度水平的快速下降與卵泡的選擇時(shí)間一致[12]，F(xiàn)SH 濃度降低，使一些卵泡不能獲得繼續(xù)生長(zhǎng)的支持，而一些卵泡可以繼續(xù)生長(zhǎng)，從而引起優(yōu)勢(shì)卵泡與從屬卵泡發(fā)生分化，使優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育至排卵卵泡。當(dāng)卵泡選擇時(shí)，F(xiàn)SH 濃度處于 FSH 波谷的最低點(diǎn)，當(dāng)注射外源 FSH 時(shí)，能夠延長(zhǎng)反芻動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)卵泡選擇[15]。卵泡選擇的另一個(gè)表現(xiàn)就是對(duì) LH 的反應(yīng)能力的獲得，當(dāng)FSH 濃度迅速升高時(shí)，使一些卵泡具有了對(duì) LH 反應(yīng)能力，，即使在 FSH 較低濃度時(shí)仍可保持良好生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)[16]。另一方面，卵泡一旦被選擇，優(yōu)勢(shì)卵泡會(huì)顯著增加雌激素和抑制素-A[17]的分泌，并通過(guò)負(fù)反饋下調(diào) FSH 的分泌（圖 1-1[18]），而其他卵泡所分泌的抑制素-B，可調(diào)控FSH 的下降速度，如果 FSH 下降速度過(guò)快，雖 LH 脈沖存在，僅有 50%的優(yōu)勢(shì)卵泡獲得發(fā)育，且母羊的排卵率顯著降低，若 FSH 逐漸下降而 LH 脈沖存在的條件下，綿羊全部排卵且排卵率在正常范圍內(nèi)[19]。因此，優(yōu)勢(shì)卵泡中雌激素和抑制素共同反饋?zhàn)饔糜谛韵佥S系統(tǒng)，抑制 FSH 的分泌，卵泡也由對(duì) FSH 敏感轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì) LH 敏感，并發(fā)育成優(yōu)勢(shì)卵泡，此過(guò)程是卵泡選擇優(yōu)勢(shì)化的重要環(huán)節(jié)。

然而 VL KOVá（2014）報(bào)道，短期補(bǔ)飼羽扇豆，對(duì) IGF-1 濃度顯著降低雌激素濃度，顯著增加 3-5 mm 卵泡的數(shù)量。Meza-Herrera（進(jìn)行短期蛋白補(bǔ)飼，血漿中 IGF-1 濃度、黃體數(shù)量和卵巢激素影響不發(fā)情前補(bǔ)飼蛋氨酸可顯著增加血漿中 IGF-1 濃度，同時(shí)增加產(chǎn)仔總數(shù)]。體外培養(yǎng)卵泡時(shí)，卵泡內(nèi)注射 IGF-1，可促進(jìn)從屬卵泡轉(zhuǎn)變成優(yōu)勢(shì)F-1 可提高依賴 FSH 的顆粒細(xì)胞分化，尤其是對(duì) LH 受體的接受性[3加 2-脫氧葡萄糖（DOG）和 3-O-甲基葡萄糖（OMG）升高，來(lái)調(diào)控性，尤其提高葡萄糖的利用率[86]。養(yǎng)調(diào)控卵泡發(fā)育的信號(hào)系統(tǒng)上研究，葡萄糖濃度升高可促進(jìn) GnRH 的脈沖釋放，緩解能量負(fù)平衡制作用[87]，同時(shí)血糖濃度升高，也會(huì)刺激胰島素和瘦素分泌，進(jìn)而增及瘦素的濃度[88]。胰島素也可在下丘腦水平上顯著增加 GnRH 基因可增強(qiáng)胰島素作用[89]，促進(jìn) GnRH 的分泌，降低卵泡閉鎖。而在能中 IGF-1 可調(diào)控卵泡分裂和卵泡生長(zhǎng)[90]，因此，在綿羊營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)卵泡萄糖-胰島素系統(tǒng)、瘦素系統(tǒng)和 IGF 系統(tǒng)[91]（圖 1-2）。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S826

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2657013