【摘要】：大腸桿菌是致病類型最多,研究最為廣泛的模式菌之一。根據(jù)其基因組特點和攜帶毒力基因的不同,大腸桿菌可以分為共生菌、腸道致病性大腸桿菌和腸道外致病性大腸桿菌(ExPEC)。ExPEC根據(jù)宿主和所涉組織器官的不同可以進(jìn)一步分為尿道致病性大腸桿菌(UPEC)、腦膜炎型大腸桿菌(NMEC)和禽致病性大腸桿菌(APEC)等。該類大腸桿菌常引起腦膜炎、膀胱感染、肺炎、腎盂腎炎和敗血癥等。目前,大多數(shù)研究聚焦于禽源和人源腸外致病性大腸桿菌,而豬源ExPEC的報道相對較少,重要性缺乏認(rèn)識。這主要是由于豬源與人源ExPEC祖系群存在一定差異,豬肉中分離的ExPEC數(shù)目也低于從禽肉中分離的ExPEC。然而,我們前期調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)我國豬源ExPEC的發(fā)病率逐年升高,許多豬源ExPEC與人源ExPEC遺傳背景和血清型相同。這些豬源ExPEC的流行病學(xué)特征、致病基因類型和致病機(jī)制仍然不清。因此,本研究對2006年-2007年間我國10個省的豬源ExPEC流行病學(xué)狀況進(jìn)行調(diào)查,對新發(fā)現(xiàn)的ST1687型腦膜炎型豬源ExPEC代表性菌株(PCN033)基因組特征進(jìn)行分析,在此基礎(chǔ)上選擇潛在毒力相關(guān)調(diào)控基因(ydiv),研究其在豬源ExPEC致病中的作用與機(jī)制。這些研究可為后續(xù)該病的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。1.豬源ExPEC流行病學(xué)狀況調(diào)查本研究對2006年至2007年間收集的81株已鑒定的豬源ExPEC樣品,分別采免疫凝集和PCR法進(jìn)行血清分群、祖系分群、多位點序列分型(MLST)和毒力基因分析。結(jié)果表明豬源ExPEC優(yōu)勢血清型為O11、O8、O138、O161和O101。81株豬源ExPEC在A、B1、B2和D四個祖系分群中均勻分布,而大部分禽源和人源ExPEC菌株主要來源于B2和D群。多位點序列分型結(jié)果表明,收集的豬源ExPEC主要由CC10、CC1687、CC88和CC58四個主要的克隆復(fù)合體組成。其中,CC1687的菌株均由我們新發(fā)現(xiàn)的序列型細(xì)菌組成。該類細(xì)菌大部分存在K1莢膜且部分菌株可從大腦和腦積液中分離,與人源腦膜炎型ExPEC類似,但缺乏人源腦膜炎型ExPEC中重要毒力因子,例如ibeA基因,表明CC1687可能具有其特殊的毒力基因組成。CC1687來源的菌株在我國不同的省份被分離到,說明該菌株已在多個省份流行。CC10復(fù)合體的部分ST型菌株在人源ExPEC中也有報道,說明豬源ExPEC也具有成為人畜共患病的潛在可能。2.不同宿主ExPEC的比較基因組學(xué)分析因不同宿主ExPEC菌株具有不同的毒力基因類型,豬源ExPEC可能與人源和其他動物源(牛源和禽源)ExPEC存在不同的毒力基因和致病機(jī)制。本課題組基于豬源ExPEC流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果,選取了我們新發(fā)現(xiàn)CC1687克隆復(fù)合體中致腦膜炎型強(qiáng)毒菌株(PCN033)測序,比較分析不同物種來源ExPEC,包括豬源(PCN033)、牛源(LS4)、禽源(APEC O1)和人源(CFT073和RS218)ExPEC的基因組差異,尋找豬源ExPEC宿主特異性和共性的毒力基因。通過對全基因組同源蛋白的Blast比較,我們發(fā)現(xiàn)腦膜炎型豬源ExPEC PCN033與其它宿主來源ExPEC比具有692個獨特基因。COG分析表明這692個豬源ExPEC PCN033特有基因與有機(jī)物代謝分解相關(guān),可能與其它菌株相比能夠利用更多的有機(jī)物,這有助于其對不同環(huán)境的適應(yīng)。對差異基因在基因組的位置分析,我們發(fā)現(xiàn)PCN033存在15個特有的基因島,其中sGI1、sGI11和sGI13存在假定的六型和三型分泌系統(tǒng),是潛在的毒力因子;豬源ExPEC在鞭毛系統(tǒng)、粘附因子和毒力基因上與其它宿主來源ExPEC存在一定差異,且人源腦膜炎型ExPEC重要毒力因子ibeA在豬源ExPEC中缺失。因此,豬源腦膜炎型ExPEC PCN033可能存在特殊的毒力因子或機(jī)制。這些毒力因子作用的調(diào)查可為腦膜炎型豬源ExPEC致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。3.豬源ExPEC鞭毛調(diào)控基因ydiv調(diào)控機(jī)制和功能研究在前期基因組分析的基礎(chǔ)上,本課題組構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的突變株,并利用小鼠模型評估調(diào)控因子缺失菌株對毒力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬源腦膜炎型ExPEC PCN033缺失c-di-GMP結(jié)構(gòu)域的假定調(diào)控蛋白Ydiv后,毒力顯著下降,說明Ydiv在ExPEC PCN033毒力調(diào)控中的重要作用。我們通過RNA-seq法比較該缺失菌株和野生菌株轉(zhuǎn)錄組水平的變化,發(fā)現(xiàn)ydiv基因可以影響12個基因的表達(dá),其中大部分基因與鞭毛相關(guān)。運動性試驗也證實ydiv基因可以影響PCN033細(xì)菌的運動能力。在對ydiv調(diào)控機(jī)制的研究中,我們通過細(xì)菌雙雜交試驗,發(fā)現(xiàn)Ydiv可以與鞭毛調(diào)控蛋白FlhD發(fā)生蛋白-蛋白相互作用;表面等離子共振試驗發(fā)現(xiàn)Ydiv蛋白可以與鞭毛調(diào)控基因flhDC和ydiv自身的啟動子發(fā)生結(jié)合。在對ydiv功能研究中,我們發(fā)現(xiàn)?ydiv突變株在體外實驗中對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng),且這種粘附能力增強(qiáng)依賴于突變株導(dǎo)致的鞭毛表達(dá)上調(diào),而無鞭毛的雙突變菌株?ydiv?fliA對血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附能力回復(fù)。在體內(nèi)試驗中,?ydiv突變株對大腦粘附能力不變,而對其它組織的粘附能力顯著下降。上述研究表明鞭毛是豬源ExPEC PCN033對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附因子。感染清除試驗表明ydiv突變株組織載菌量的下降是由于突變菌株鞭毛的大量表達(dá)導(dǎo)致其與野生菌株比更容易被宿主清除,推測鞭毛的表達(dá)可以促進(jìn)免疫吞噬細(xì)胞的識別和清除。巨噬細(xì)胞吞噬試驗結(jié)果與我們推測相符合,即?ydiv菌株被巨噬細(xì)胞吞噬率高于野生菌株,而?ydiv?fliA菌株被巨噬細(xì)胞吞噬率低于野生菌株,表明鞭毛可以介導(dǎo)免疫吞噬細(xì)胞對ExPEC的識別和吞噬。這些研究表明鞭毛是豬源ExPEC對血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要粘附因子,Ydiv一方面可以通過蛋白-蛋白作用和蛋白-DNA作用的雙重機(jī)制抑制鞭毛基因的表達(dá),減少ExPEC被免疫吞噬細(xì)胞識別和清除,促進(jìn)ExPEC在宿主體內(nèi)存活,另一方面Ydiv通過自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)避免對鞭毛的過度抑制,保留其對腦組織的粘附和侵入能力。
【圖文】：

圖 1.1： 大腸桿菌（https://foodconsulting.co.za）性大腸桿菌菌群比，致病性大腸桿菌存在特殊于可移動的基因元件上，通過毒力基因在大數(shù)目和毒力因子組合的菌株。某一特殊的毒力

1.2：尿道致病性大腸桿菌感染部位(Terlizzi et al., 2中，，隨著耐藥性不斷增多和免疫抑制性疾病，由 ExPEC 感染引起的疾病的發(fā)病率也逐年上括菌血癥、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、肺炎等。為我國 ExPEC 的發(fā)病率從 2004 年的 3.1%上升到 20驗室也發(fā)現(xiàn)一些與人 ExPEC 具有相同血清型xPEC 類似。國外相關(guān)研究中，巴塞羅那、倫離的 ExPEC 也與該地域感染尿道致病性大腸n et al., 1994; Pitout et al., 2005; Manges et al.明豬源 ExPEC 存在導(dǎo)致人畜共患病的潛在狀況，遺傳信息和致病機(jī)制是預(yù)防和控制該生的保障存在積極意義。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.612

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本文編號：2655826