【摘要】：原始生殖細(xì)胞(primordial germ cell,PGCs)作為配子的祖先細(xì)胞,是生殖細(xì)胞發(fā)育過程中必不可少的。研究PGCs的發(fā)生和分化機(jī)理對(duì)動(dòng)物種質(zhì)資源保存、創(chuàng)新利用以及基因修飾雞的生產(chǎn)等領(lǐng)域具有重要理論和實(shí)踐意義。PGCs的發(fā)生受到許多因素的影響。目前,研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵性的基因、信號(hào)通路、生長因子和表觀遺傳修飾因素對(duì)PGCs的發(fā)生起重要調(diào)控作用。盡管這些因素對(duì)于PGCs形成起到了一定的促進(jìn)作用,但體外誘導(dǎo)PGCs的生成效率并沒有得到提高。因此,亟需從新的領(lǐng)域?qū)GCs的生成機(jī)制進(jìn)行創(chuàng)新性地探究,深入了解和認(rèn)識(shí)PGCs的形成過程,以期獲取能夠滿足生產(chǎn)研究所需的大量PGCs細(xì)胞。隨著測序技術(shù)和生物信息分析技術(shù)的發(fā)展,長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在生殖細(xì)胞分化與胚胎發(fā)育過程中的作用逐漸受到重視。研究lncRNA對(duì)PGCs發(fā)生的影響及機(jī)制,能夠?yàn)樘岣逷GCs體外生成效率提供新的研究策略。本研究基于前期單細(xì)胞高通量測序結(jié)果篩選得到雞PGCs特異表達(dá)lncRNA-M1ANCR,利用RNA干擾技術(shù),以家雞為研究對(duì)象,從體內(nèi)和體外兩個(gè)水平探究了 lncRNA-M1ANCR在PGCs發(fā)生過程中的功能和機(jī)制,為有效提高PGCs效率提供理論依據(jù)和參考。研究結(jié)果如下:(1)lncRNA-M1ANCR的全長擴(kuò)增,細(xì)胞定位與編碼能力鑒定:基于前期高通量測序篩選得到PGCs特異性表達(dá)lncRNA,命名為lncRNA-M1ANCR,通過RACE實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增獲得 lncRNA-M1ANCR 全長(共計(jì) 1115bp),qRT-PCR 驗(yàn)證了 lncRNA 在 PGCs 中特異性高表達(dá)(ESCs:1.021±0.231,PGCs:5.131±1.23,SSCs:1.825±0.828),與轉(zhuǎn)錄組測序(ESCs:1.143±0.350,PGCs:37.131±1.053,SSCs:6.825±0.923)結(jié)果一致,細(xì)胞定位監(jiān)測發(fā)現(xiàn)lncRNA-M1ANCR定位于PGCs細(xì)胞質(zhì)中(細(xì)胞核:0.773±0.051,細(xì)胞質(zhì):3.395±0.583);生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)lncRNA-M1ANCR的4bp-115bp為開放閱讀框序列,構(gòu)建原核融合表達(dá)載體發(fā)現(xiàn)該序列在BL菌種中不表達(dá)蛋白,表明明lncRNA-M1ANCR不存在編碼小肽能力。(2)體內(nèi)外研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成過程中的功能:根據(jù)lncRNA-M1ANCR全長序列,設(shè)計(jì)三個(gè)shRNA靶位點(diǎn),連入pGMLV-SC5干擾載體,轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后通過定量檢測發(fā)現(xiàn)3號(hào)靶位點(diǎn)的干擾效率(67.16%±2.0%)最高且顯著高于對(duì)照組(P0.01);同時(shí),克隆lncRNA-M1ANCR全長,構(gòu)建pcDNA-M1ANCR過表達(dá)載體;然后,將lncRNA-M1ANCR慢病毒干擾載體與過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染雞ESCs,在RA誘導(dǎo)條件下,觀察細(xì)胞分化形態(tài)的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾lncRNA后,類PGCs形成數(shù)量(3±1/400×視野)較RA單獨(dú)誘導(dǎo)組(10±2個(gè)/400×視野)和過表達(dá)組(12±2個(gè)/400×視野)顯著減少;進(jìn)一步采用qRT-PCR檢測PGCs細(xì)胞特異性標(biāo)記基因Cvh和C-kit的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),干擾組的表達(dá)量(CvA:1.029±0.062,C-kit:1.154±0.009)顯著低于過表達(dá)組(Cvh:1.672±0.123,C-kit:2.232±0.029)和誘導(dǎo)組(CvA:1.232±0.234,C-kit:1.561±0.017)(P0.01),而全能性基因Nanog的表達(dá)(Nanog:1.029±0.024)則顯著高于過表達(dá)組(Nanog:0.918±0.038)與誘導(dǎo)組(Nanog:0.984±0.033)(P0.01);間接免疫熒光檢測結(jié)果表明,干擾組Cvh的表達(dá)顯著低于RA誘導(dǎo)組和過表達(dá)組;流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn),干擾組誘導(dǎo)4d后產(chǎn)生的類PGCs細(xì)胞(3.96%±0.32%)顯著少于RA誘導(dǎo)組(9.67%±0.24%)和過表達(dá)組(12.1%±0.46%)(P0.01);體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,將干擾載體與過表達(dá)載體通過血管注射整合進(jìn)入雞胚后,檢測生殖標(biāo)記基因在PGCs的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)均出現(xiàn)顯著性下降(Cvh:2.631±0.208,C-kit:3.028±0.23)(P0.01),同時(shí)通過石蠟切片觀察PGCs細(xì)胞在生殖嵴的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)干擾組PGCs的形成明顯減少(15±0.57個(gè));為進(jìn)一步說明lncRNA對(duì)PGCs形成的影響,流式細(xì)胞分選儀檢測干擾lncRNA后PGCs的形成被抑制(4.0%±1.1%),與體外誘導(dǎo)結(jié)果一致。結(jié)果表明,lncRNA-M1ANCR對(duì)雞ESCs向PGCs的分化過程具有正向調(diào)控作用。(3)lncRNA-M1ANCR啟動(dòng)子核心區(qū)域鑒定與轉(zhuǎn)錄因子分析:根據(jù)RACE結(jié)果預(yù)測lncRNA-M1ANCR啟動(dòng)子區(qū)域并構(gòu)建真核表達(dá)載體p0-EGFP,轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞發(fā)現(xiàn),克隆片段能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光,確定該區(qū)域具有啟動(dòng)子活性;分別構(gòu)建啟動(dòng)子缺失載體 pGL3-p1-783,pGL3-p2-530,pGL3-p3-269 與 pGL3-p3x 后,轉(zhuǎn)染 DF-1 細(xì)胞,進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告檢測,結(jié)果表明,pGL3-p3-269的啟動(dòng)活性最高(4.39±0.35),說明在-269bp～-1bp中存在重要的調(diào)控作用元件,對(duì)啟動(dòng)子活性具有重要影響。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析獲知,在啟動(dòng)子區(qū)域-269bp～-1bp間存在轉(zhuǎn)錄因子p53的結(jié)合位點(diǎn),為探究p53對(duì)啟動(dòng)子活性是否具有調(diào)控作用,本研究構(gòu)建了 p53的干擾載體與過表達(dá)載體。分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后檢測缺失片段的雙熒光素酶活性,發(fā)現(xiàn)干擾p53后核心區(qū)域的活性(1.65±0.53)顯著低于正常組(4.06±0.41)和過表達(dá)組(4.55±0.66)。綜上表明,轉(zhuǎn)錄因子p53能夠調(diào)控lncRNA-M1ANCR啟動(dòng)子核心區(qū)域的活性,進(jìn)而調(diào)控lncRNA的表達(dá)。(4)lncRNA-M1ANCR與gga-mir-1591競爭性結(jié)合抑制機(jī)制的初步探究:lncRNA具有潛在的ceRNA特性,本研究通過生物信息學(xué)分析得到與lncRNA-M1ANCR存在潛在競爭性結(jié)合關(guān)系的miRNA(gga-mir-1591,gga-mir-3539),分別構(gòu)建miRNA的模擬物與抑制物,并在RA誘導(dǎo)條件下體外轉(zhuǎn)染雞ESCs細(xì)胞,通過細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),抑制gga-mir-1591的表達(dá)能夠促進(jìn)類PGCs的形成,而模擬gga-mir-1591的表達(dá)則干擾類PGCs的形成,gga-mir-3593的模擬物與抑制物對(duì)類PGCs的形成無明顯作用;同時(shí)通過qRT-PCR檢測lncRNA-M1ANCR,MAPK7,全能性基因以及生殖標(biāo)記基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染gga-mir-1591抑制物后,MAPK1與lncRNA的表達(dá)顯著上調(diào)(MAPK1:12.293±2.012,lncRNA-M1ANCR:2.137±0.324),生殖標(biāo)記基因的表達(dá)量(Cvh:6.731±0.921,C-kit:6.631±0.918)也顯著高于其他組別;為進(jìn)一步驗(yàn)證gga-mir-1591對(duì)雞PGCs形成的影響,本研究通過流式分析檢測發(fā)現(xiàn),抑制gga-mir-1591后,類PGCs的陽性細(xì)胞率(3.13±0.22%)顯著高于其他組別(P0.01),表明miRNA gga-mir-1591對(duì)雞ESCs向PGCs的分化過程具有調(diào)控作用,與lncRNA-M1ANCR可能存在競爭性結(jié)合抑制關(guān)系。為進(jìn)一步驗(yàn)證gga-mir-1591與lncRNA-M1ANCR之間的關(guān)系,本研究在轉(zhuǎn)染gga-mir-1591模擬物與抑制物的基礎(chǔ)上,分別轉(zhuǎn)染了 lncRNA-M1ANCR的過表達(dá)載體與干擾載體,通過拯救實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證兩者之間存在的競爭性結(jié)合抑制關(guān)系。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制gga-mir-1591 后類 PGCs 的形成能夠受 lncRNA 干擾載體的影響,導(dǎo)致類 PGCs 形成減少,反之亦然;同時(shí)通過qRT-PCR檢測lncRNA-M1ANCR,MAPK1,全能性基因以及生殖標(biāo)記基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),在抑制gga-mir-1591表達(dá)同時(shí)干擾lncRNA情況下,MAPK1的表達(dá)量較抑制gga-mir-1591組顯著降低(P0.01),生殖標(biāo)記基因的表達(dá)也有顯著下降(P0.05);綜上表明,gga-mir-1591 與 lncRNA-M1ANCR 存在競爭性結(jié)合關(guān)系,lncRNA-M1ANCR 通過“海綿樣”吸附的方式,競爭性結(jié)合靶向作用于 MAPK1 的 miRNA gga-mir-1591,調(diào)控MAPK1的表達(dá)水平,進(jìn)而調(diào)控雞PGCs的形成。(5)lncRNA-M1ANCR互作蛋白的篩選與鑒定:通過對(duì)lncRNA-M1ANCR的RNA pull down結(jié)果分析得到,在雞ESCs向PGCs分化過程中l(wèi)ncRNA-M1ANCR與ILF3蛋白存在潛在相互作用關(guān)系,為進(jìn)一步驗(yàn)證兩者之間的作用機(jī)制,本研究通過Western Blot實(shí)驗(yàn)確定了 ILF3蛋白在雞PGCs中存在表達(dá),并通過RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ILF3與lncRNA間存在結(jié)合。為了進(jìn)一步探究兩者之間的互作關(guān)系,本研究對(duì)與ILF3與lncRNA相關(guān)的下游信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因進(jìn)行了 qRT-PCR檢測,結(jié)果表明干擾lncRNA后,下游信號(hào)通路關(guān)鍵基因MAPK與Wnt(MAPK:10.342±1.192,Wnt:6.323±0.624)較過表達(dá)組(MAPK:14.432±1.394,Wnt:10.960±0.934)顯著降低。綜上表明,在雞PGC的形成過程中,lncRNA-M1ANCR與ILF3蛋白間存在互作關(guān)系,并且lncRNA表達(dá)的變化能夠影響下游信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)。
【圖文】：

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本文編號(hào)：2655847