【摘要】：豬病毒性腹瀉是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)常見(jiàn)的腸道性疫病,其主要病原包括豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virusof swine,TGEV)和豬輪狀病毒(Porcine rotarvirus,Po RV),其中,PEDV感染率和死亡率均最高。當(dāng)前,豬病毒性腹瀉防控技術(shù)主要以疫苗免疫為主,已有商品化疫苗但無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),免疫原性差,仔豬發(fā)病率高。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,益生菌可作為綠色環(huán)保型添加劑,與核酸疫苗聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)其免疫效果,提高仔豬的生長(zhǎng)性能、細(xì)胞免疫和黏膜免疫水平,促進(jìn)免疫器官和小腸絨毛的發(fā)育。本試驗(yàn)篩選與貴州省流行毒株親緣關(guān)系較近候選疫苗株,取妊娠母豬跟胎免疫方法,探討復(fù)合益生菌對(duì)豬病毒性腹瀉免疫效果的影響研究。具體研究?jī)?nèi)容如下:1.貴州省PEDV部分毒株分子流行病學(xué)研究:采集貴州某規(guī)模化豬場(chǎng)新生仔豬腸道內(nèi)容物和糞便120份,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定獲得PEDV S和M全基因序列,生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:S基因核苷酸序列全長(zhǎng)4 161bp,編碼1 386個(gè)氨基酸,將該毒株命名為GZFQ11-2016;M基因核苷酸序列全長(zhǎng)681 bp,編碼226個(gè)氨基酸,將該毒株命名為GZFQ06-2017。S基因序列與參考毒株CV777和KH的同源性86.6%為最高,并處在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)同一分支,M基因與Attenuated DR13、SC1402和SQ2014的同源性71.4%為最高,并處在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)同一分支,與參考毒株CV777的同源性70.6%次之。GZFQ11-2016和GZFQ06-2017株與多個(gè)參考毒株相比發(fā)生了基因突變或變異,但與參考毒株CV777的同源性相對(duì)較高,說(shuō)明參考毒株CV777可作為貴州省PEDV疫苗候選毒株。2.豬病毒性腹瀉疫苗免疫抗體消長(zhǎng)規(guī)律研究:篩選PEDV、TGEV和Po RV抗體和抗原為雙陰性妊娠母豬100頭,平均分為試驗(yàn)A、B、C、D組和對(duì)照組。其中,試驗(yàn)A組產(chǎn)前40 d首免和產(chǎn)前20 d二免均接種“PTR”三聯(lián)弱毒疫苗(以下均簡(jiǎn)稱(chēng)“PTR”),試驗(yàn)B組產(chǎn)前40 d首免和產(chǎn)前20 d二免均接種“PT”二聯(lián)滅活疫苗(以下均簡(jiǎn)稱(chēng)“PT”),試驗(yàn)C組產(chǎn)前40 d首免“PTR”和產(chǎn)前20 d二免“PT”,試驗(yàn)D組產(chǎn)前40 d首免“PT”和產(chǎn)前20 d二免“PTR”,對(duì)照組產(chǎn)前40 d和產(chǎn)前20 d均注射生理鹽水。試驗(yàn)A、B、C和D組所產(chǎn)的仔豬隨機(jī)選取20頭,分為第一組、第二組、第三組和第四組,仔豬均28日齡首免和65日齡二免,免疫程序與母豬相同。對(duì)照組母豬所產(chǎn)仔豬隨機(jī)選取60頭分為3組,其中,第五組3日齡肌肉接種PTR和35日齡肌肉接種PTR、第六組1~3日齡滴鼻接種PTR和28日齡免疫PTR和對(duì)照組。母豬分娩后0 d~14 d采集乳汁利用ELISA方法檢測(cè)PEDV SIg A抗體滴度;仔豬7日齡~80日齡采血并離心取上清,采用ELISA方法檢測(cè)其PEDV、TGEV和Po RV Ig G抗體滴度。結(jié)果顯示:產(chǎn)前40 d和產(chǎn)前20 d只注射PT或PTR的豬群分娩后7~10 d乳汁中PEDV SIg A抗體滴度低于產(chǎn)前40 d和產(chǎn)前20 d注射PTR和PT分娩第14 d乳汁中PEDV SIg A抗體滴度。表明分別接種PTR和PT的效果優(yōu)于免疫單一PTR或PT,所產(chǎn)仔豬3日齡滴鼻接種PTR,28日齡二次免疫PTR和65日齡三次免疫PT,15 d后抗體滴度處于上升動(dòng)態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中,試驗(yàn)C組臨床效果最佳。3.益生菌對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、細(xì)胞免疫及黏膜免疫水平的影響研究:將試驗(yàn)C組母豬所產(chǎn)仔豬在哺乳階段隨機(jī)選取120頭,均分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。仔豬21日齡斷奶,哺乳階段仔豬試驗(yàn)組豬群60頭平均分為試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組,分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.10%、0.20%、0.30%復(fù)合益生菌,哺乳階段對(duì)照組豬群隨機(jī)選取20頭作為對(duì)照組(不含復(fù)合益生菌)。對(duì)不同階段仔豬其生長(zhǎng)性能、血液生理生化、血清細(xì)胞因子、腸道黏膜SIg A、免疫器官M(fèi)C分泌及小腸絨毛發(fā)育等水平進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示:復(fù)合益生菌能顯著提高哺乳仔豬的平均日增重(P0.05),降低哺乳仔豬腹瀉率(P0.01);增加仔豬血液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板數(shù)量(P0.05);血清乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)和總蛋白(TP)含量均高于對(duì)照組(P0.01),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和血清尿素氮(BUN)含量均高于對(duì)照組(P0.05);增加IL-6、IL-1β和TNF-a分泌量(P0.05);提高十二指腸、回腸和盲腸黏膜SIg A水平(P0.05)和空腸黏膜SIg A水平分泌(P0.01);免疫器官中MC分泌數(shù)量極顯著高于對(duì)照組(P0.01);十二指腸和回腸絨毛結(jié)構(gòu)較對(duì)照組完整,排列整齊,但隱窩均值試驗(yàn)組極顯著高于對(duì)照組(P0.01),絨毛均值試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P0.05),試驗(yàn)組空?qǐng)鼋q毛均值與隱窩均值均極顯著高于對(duì)照組(P0.01),但空腸和回腸絨毛隱窩比均值試驗(yàn)組極顯著低于對(duì)照組(P0.01),十二指腸試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組(P0.05)。早期斷奶階段中,試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組末重極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組(P0.01);試驗(yàn)Ⅲ組平均日增重極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組及對(duì)照組(P0.01),試驗(yàn)Ⅲ組平均日采食量顯著高于試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組及對(duì)照組(P0.05),對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅱ組腹瀉率均極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組(P0.01);試驗(yàn)組中的LDH、ALT和ALP含量均高于對(duì)照組,TP含量低于對(duì)照組,差異均不顯著(P0.05);試驗(yàn)組中BUN含量均顯著高于對(duì)照組(P0.05),試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組AST含量顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組(P0.05)。試驗(yàn)20 d,試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組中IL-6水平極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組及對(duì)照組(P0.01),IL-1β和TNF-α水平與對(duì)照組相比差異不顯著(P0.05);試驗(yàn)40 d,試驗(yàn)組IL-1β水平均顯著高于對(duì)照組(P0.05),IL-6和TNF-a水平均極顯著高于對(duì)照組(P0.01)。試驗(yàn)組中空腸黏膜SIg A水平極顯著高于對(duì)照組(P0.01);十二指腸和回腸黏膜SIg A水平均顯著高于對(duì)照組(P0.05),盲腸黏膜SIg A水平低于對(duì)照組,差異不顯著(P0.05);腹股溝淋巴結(jié)MC分泌數(shù)量試驗(yàn)Ⅱ組高于試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅲ組(P0.01);胸腺M(fèi)C分泌數(shù)量試驗(yàn)Ⅱ組高于試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅲ組(P0.01);脾臟MC分泌數(shù)量試驗(yàn)Ⅲ組高于試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組(P0.01);十二指腸、空?qǐng)龊突啬c絨毛均值試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組(P0.01);對(duì)隱窩均值來(lái)說(shuō),十二指腸和空腸試驗(yàn)Ⅱ組極顯著高于試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ組和對(duì)照組(P0.01),回腸試驗(yàn)Ⅰ組極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組和對(duì)照組(P0.01)。說(shuō)明復(fù)合益生菌可提高仔豬的生長(zhǎng)性能、細(xì)胞和黏膜免疫水平,促進(jìn)免疫器官和小腸發(fā)育。綜上所述:成功克隆貴州省2株P(guān)EDV S和M基因,通過(guò)生物信息學(xué)分析說(shuō)明貴州省近幾年新流行毒株與參考毒株CV777親緣關(guān)系最近,表明參考毒株CV777可作為當(dāng)前貴州省疫苗選擇候選毒株。妊娠母豬產(chǎn)前40 d和產(chǎn)前20 d分別注射PTR和PT免疫效果優(yōu)于PTR或PT,所產(chǎn)仔豬3日齡滴鼻接種PTR,28日齡二次免疫PTR和65日齡三次免疫PT,此免疫程序中乳汁中PEDV SIg A抗體以及PEDV、TGEV和Po RV Ig G抗體滴度維持時(shí)間較長(zhǎng),得出試驗(yàn)C組免疫效果最佳。篩選試驗(yàn)C組所產(chǎn)仔豬結(jié)合復(fù)合益生菌應(yīng)用于哺乳階段和斷奶階段仔豬,得出最佳復(fù)合益生菌添加比例為0.30%,可提高哺乳仔豬和早期斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能,增強(qiáng)仔豬細(xì)胞免疫和黏膜免疫水平,有助于哺乳仔豬和早期斷奶仔豬免疫器官M(fèi)C分化和小腸絨毛的發(fā)育。
【圖文】：

基因組 5’端有帽子結(jié)構(gòu)(cap)，3’端有 poly(A)尾，具有侵染性�；蛑饕慕Y(jié)構(gòu)蛋白有纖突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、核ucleocapsid，N)和小膜蛋白(small Membrane，sM)(Brian D，2005)，，蛋白 1-15(nonstructural protein，nsp)和 ORF3。PEDV M 基因全長(zhǎng) 681 個(gè)氨基酸，組成病毒的表面結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為 27ku-32ku，是一種。M 蛋白無(wú)信號(hào)肽，預(yù)測(cè)具有 3 個(gè)跨膜區(qū)域，包含兩個(gè) RNA 結(jié)合結(jié)位于病毒外面的氨基末端結(jié)構(gòu)域和病毒內(nèi)部的羧基結(jié)構(gòu)域(Utiger Ae保守性相對(duì)較高。有研究表明，M 蛋白可以與 M 蛋白自身和 S 蛋白在病毒組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Utiger Aetal，1995；Siddell S G, 199屬于冠狀病毒科的SARS 病毒其 M 蛋白具有干擾素拮抗活性(Siu e此 M 蛋白常被研究者作為檢測(cè) PEDV 引物設(shè)計(jì)的首選，同時(shí) M 蛋 PEDV 基因工程疫苗的候選抗原(高慎陽(yáng)等，2007)。

M: DNA marker DL2000;S1,S2,S3:S 基因分節(jié) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；1,2:M 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M:DNA Marker DL2000;S1,S2 ,d S3:PCR product of S gene segmental；1,2:PCR product of M圖 1-1 PEDV S 和 M 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1-1 PCR amplification for PEDV S and M gene
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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