【摘要】：豬病毒性腹瀉是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)常見的腸道性疫病,其主要病原包括豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virusof swine,TGEV)和豬輪狀病毒(Porcine rotarvirus,Po RV),其中,PEDV感染率和死亡率均最高。當(dāng)前,豬病毒性腹瀉防控技術(shù)主要以疫苗免疫為主,已有商品化疫苗但無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),免疫原性差,仔豬發(fā)病率高。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道,益生菌可作為綠色環(huán)保型添加劑,與核酸疫苗聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)其免疫效果,提高仔豬的生長性能、細(xì)胞免疫和黏膜免疫水平,促進(jìn)免疫器官和小腸絨毛的發(fā)育。本試驗篩選與貴州省流行毒株親緣關(guān)系較近候選疫苗株,取妊娠母豬跟胎免疫方法,探討復(fù)合益生菌對豬病毒性腹瀉免疫效果的影響研究。具體研究內(nèi)容如下:1.貴州省PEDV部分毒株分子流行病學(xué)研究:采集貴州某規(guī)�；i場新生仔豬腸道內(nèi)容物和糞便120份,通過RT-PCR擴(kuò)增、序列測定獲得PEDV S和M全基因序列,生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:S基因核苷酸序列全長4 161bp,編碼1 386個氨基酸,將該毒株命名為GZFQ11-2016;M基因核苷酸序列全長681 bp,編碼226個氨基酸,將該毒株命名為GZFQ06-2017。S基因序列與參考毒株CV777和KH的同源性86.6%為最高,并處在系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支,M基因與Attenuated DR13、SC1402和SQ2014的同源性71.4%為最高,并處在系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支,與參考毒株CV777的同源性70.6%次之。GZFQ11-2016和GZFQ06-2017株與多個參考毒株相比發(fā)生了基因突變或變異,但與參考毒株CV777的同源性相對較高,說明參考毒株CV777可作為貴州省PEDV疫苗候選毒株。2.豬病毒性腹瀉疫苗免疫抗體消長規(guī)律研究:篩選PEDV、TGEV和Po RV抗體和抗原為雙陰性妊娠母豬100頭,平均分為試驗A、B、C、D組和對照組。其中,試驗A組產(chǎn)前40 d首免和產(chǎn)前20 d二免均接種“PTR”三聯(lián)弱毒疫苗(以下均簡稱“PTR”),試驗B組產(chǎn)前40 d首免和產(chǎn)前20 d二免均接種“PT”二聯(lián)滅活疫苗(以下均簡稱“PT”),試驗C組產(chǎn)前40 d首免“PTR”和產(chǎn)前20 d二免“PT”,試驗D組產(chǎn)前40 d首免“PT”和產(chǎn)前20 d二免“PTR”,對照組產(chǎn)前40 d和產(chǎn)前20 d均注射生理鹽水。試驗A、B、C和D組所產(chǎn)的仔豬隨機(jī)選取20頭,分為第一組、第二組、第三組和第四組,仔豬均28日齡首免和65日齡二免,免疫程序與母豬相同。對照組母豬所產(chǎn)仔豬隨機(jī)選取60頭分為3組,其中,第五組3日齡肌肉接種PTR和35日齡肌肉接種PTR、第六組1~3日齡滴鼻接種PTR和28日齡免疫PTR和對照組。母豬分娩后0 d~14 d采集乳汁利用ELISA方法檢測PEDV SIg A抗體滴度;仔豬7日齡~80日齡采血并離心取上清,采用ELISA方法檢測其PEDV、TGEV和Po RV Ig G抗體滴度。結(jié)果顯示:產(chǎn)前40 d和產(chǎn)前20 d只注射PT或PTR的豬群分娩后7~10 d乳汁中PEDV SIg A抗體滴度低于產(chǎn)前40 d和產(chǎn)前20 d注射PTR和PT分娩第14 d乳汁中PEDV SIg A抗體滴度。表明分別接種PTR和PT的效果優(yōu)于免疫單一PTR或PT,所產(chǎn)仔豬3日齡滴鼻接種PTR,28日齡二次免疫PTR和65日齡三次免疫PT,15 d后抗體滴度處于上升動態(tài)。本實驗中,試驗C組臨床效果最佳。3.益生菌對仔豬生長性能、細(xì)胞免疫及黏膜免疫水平的影響研究:將試驗C組母豬所產(chǎn)仔豬在哺乳階段隨機(jī)選取120頭,均分為試驗組和對照組。仔豬21日齡斷奶,哺乳階段仔豬試驗組豬群60頭平均分為試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組,分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.10%、0.20%、0.30%復(fù)合益生菌,哺乳階段對照組豬群隨機(jī)選取20頭作為對照組(不含復(fù)合益生菌)。對不同階段仔豬其生長性能、血液生理生化、血清細(xì)胞因子、腸道黏膜SIg A、免疫器官M(fèi)C分泌及小腸絨毛發(fā)育等水平進(jìn)行評估。結(jié)果顯示:復(fù)合益生菌能顯著提高哺乳仔豬的平均日增重(P0.05),降低哺乳仔豬腹瀉率(P0.01);增加仔豬血液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板數(shù)量(P0.05);血清乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)和總蛋白(TP)含量均高于對照組(P0.01),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和血清尿素氮(BUN)含量均高于對照組(P0.05);增加IL-6、IL-1β和TNF-a分泌量(P0.05);提高十二指腸、回腸和盲腸黏膜SIg A水平(P0.05)和空腸黏膜SIg A水平分泌(P0.01);免疫器官中MC分泌數(shù)量極顯著高于對照組(P0.01);十二指腸和回腸絨毛結(jié)構(gòu)較對照組完整,排列整齊,但隱窩均值試驗組極顯著高于對照組(P0.01),絨毛均值試驗組顯著高于對照組(P0.05),試驗組空場絨毛均值與隱窩均值均極顯著高于對照組(P0.01),但空腸和回腸絨毛隱窩比均值試驗組極顯著低于對照組(P0.01),十二指腸試驗組顯著低于對照組(P0.05)。早期斷奶階段中,試驗Ⅱ、Ⅲ組末重極顯著高于試驗Ⅰ組和對照組(P0.01);試驗Ⅲ組平均日增重極顯著高于試驗Ⅰ、Ⅱ組及對照組(P0.01),試驗Ⅲ組平均日采食量顯著高于試驗Ⅰ、Ⅱ組及對照組(P0.05),對照組、試驗Ⅱ組腹瀉率均極顯著高于試驗Ⅰ、Ⅲ組(P0.01);試驗組中的LDH、ALT和ALP含量均高于對照組,TP含量低于對照組,差異均不顯著(P0.05);試驗組中BUN含量均顯著高于對照組(P0.05),試驗Ⅱ、Ⅲ組AST含量顯著高于試驗Ⅰ組和對照組(P0.05)。試驗20 d,試驗Ⅱ、Ⅲ組中IL-6水平極顯著高于試驗Ⅰ組及對照組(P0.01),IL-1β和TNF-α水平與對照組相比差異不顯著(P0.05);試驗40 d,試驗組IL-1β水平均顯著高于對照組(P0.05),IL-6和TNF-a水平均極顯著高于對照組(P0.01)。試驗組中空腸黏膜SIg A水平極顯著高于對照組(P0.01);十二指腸和回腸黏膜SIg A水平均顯著高于對照組(P0.05),盲腸黏膜SIg A水平低于對照組,差異不顯著(P0.05);腹股溝淋巴結(jié)MC分泌數(shù)量試驗Ⅱ組高于試驗Ⅰ組和試驗Ⅲ組(P0.01);胸腺M(fèi)C分泌數(shù)量試驗Ⅱ組高于試驗Ⅰ組和試驗Ⅲ組(P0.01);脾臟MC分泌數(shù)量試驗Ⅲ組高于試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組(P0.01);十二指腸、空場和回腸絨毛均值試驗Ⅱ、Ⅲ組極顯著高于試驗Ⅰ組和對照組(P0.01);對隱窩均值來說,十二指腸和空腸試驗Ⅱ組極顯著高于試驗Ⅰ、Ⅲ組和對照組(P0.01),回腸試驗Ⅰ組極顯著高于試驗Ⅱ、Ⅲ組和對照組(P0.01)。說明復(fù)合益生菌可提高仔豬的生長性能、細(xì)胞和黏膜免疫水平,促進(jìn)免疫器官和小腸發(fā)育。綜上所述:成功克隆貴州省2株P(guān)EDV S和M基因,通過生物信息學(xué)分析說明貴州省近幾年新流行毒株與參考毒株CV777親緣關(guān)系最近,表明參考毒株CV777可作為當(dāng)前貴州省疫苗選擇候選毒株。妊娠母豬產(chǎn)前40 d和產(chǎn)前20 d分別注射PTR和PT免疫效果優(yōu)于PTR或PT,所產(chǎn)仔豬3日齡滴鼻接種PTR,28日齡二次免疫PTR和65日齡三次免疫PT,此免疫程序中乳汁中PEDV SIg A抗體以及PEDV、TGEV和Po RV Ig G抗體滴度維持時間較長,得出試驗C組免疫效果最佳。篩選試驗C組所產(chǎn)仔豬結(jié)合復(fù)合益生菌應(yīng)用于哺乳階段和斷奶階段仔豬,得出最佳復(fù)合益生菌添加比例為0.30%,可提高哺乳仔豬和早期斷奶仔豬的生長性能,增強(qiáng)仔豬細(xì)胞免疫和黏膜免疫水平,有助于哺乳仔豬和早期斷奶仔豬免疫器官M(fèi)C分化和小腸絨毛的發(fā)育。
【圖文】：

基因組 5’端有帽子結(jié)構(gòu)(cap)，3’端有 poly(A)尾，具有侵染性�；蛑饕慕Y(jié)構(gòu)蛋白有纖突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、核ucleocapsid，N)和小膜蛋白(small Membrane，sM)(Brian D，2005)，，蛋白 1-15(nonstructural protein，nsp)和 ORF3。PEDV M 基因全長 681 個氨基酸，組成病毒的表面結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為 27ku-32ku，是一種。M 蛋白無信號肽，預(yù)測具有 3 個跨膜區(qū)域，包含兩個 RNA 結(jié)合結(jié)位于病毒外面的氨基末端結(jié)構(gòu)域和病毒內(nèi)部的羧基結(jié)構(gòu)域(Utiger Ae保守性相對較高。有研究表明，M 蛋白可以與 M 蛋白自身和 S 蛋白在病毒組裝過程中發(fā)揮重要作用(Utiger Aetal，1995；Siddell S G, 199屬于冠狀病毒科的SARS 病毒其 M 蛋白具有干擾素拮抗活性(Siu e此 M 蛋白常被研究者作為檢測 PEDV 引物設(shè)計的首選，同時 M 蛋 PEDV 基因工程疫苗的候選抗原(高慎陽等，2007)。

M: DNA marker DL2000;S1,S2,S3:S 基因分節(jié) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；1,2:M 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M:DNA Marker DL2000;S1,S2 ,d S3:PCR product of S gene segmental；1,2:PCR product of M圖 1-1 PEDV S 和 M 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1-1 PCR amplification for PEDV S and M gene
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 毛黎紅;王開功;周碧君;文明;程振濤;溫貴蘭;馮旭芳;;貴州省部分地區(qū)規(guī)�；i場仔豬4種致豬腹瀉病病毒感染調(diào)查[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年05期

2 ;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院“豬腹瀉三聯(lián)苗”正式投產(chǎn)上市[J];畜禽業(yè);2015年04期

3 ;哈獸研自主研制的豬腹瀉三聯(lián)苗成功上市[J];豬業(yè)觀察;2015年02期

4 劉輝;季海峰;王四新;張董燕;王晶;單達(dá)聰;王雅民;;益生菌對生長豬生長性能、糞便微生物數(shù)量、養(yǎng)分表觀消化率和血清免疫指標(biāo)的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2015年03期

5 張德曉;李杰;栗敏;;復(fù)合益生菌制劑在妊娠母豬和哺乳仔豬中的應(yīng)用[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2015年03期

6 陳穎;朱萍妹;劉巧玲;潘華;周光興;;常用實驗動物不同組織部位肥大細(xì)胞異質(zhì)性的組織學(xué)特點比較[J];中國實驗動物學(xué)報;2014年06期

7 王雪;張圣方;趙龍玉;趙鳳春;楊正友;;長根菇多糖對小鼠腸道菌群及分泌型IgA的影響[J];食品工業(yè)科技;2015年13期

8 曹力;武曉紅;;乳酸桿菌的腸道調(diào)節(jié)作用及其在動物生產(chǎn)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年11期

9 王隆柏;林裕勝;車勇良;吳學(xué)敏;陳如敬;邵良平;周倫江;;豬流行性腹瀉病毒S、N和ORF3基因的遺傳變異分析[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2014年11期

10 楚青惠;汪官保;曾勇慶;張哲;趙勇;張建梅;武慕達(dá);謝偉仕;;飼喂乳酸菌對母豬和哺乳仔豬生長性能、血清生化指標(biāo)及糞便微生物數(shù)量的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2014年11期

本文編號：2655767