【摘要】：禽呼腸孤病毒(AvianReovirus,ARV)是一種重要的禽類病原,在臨床上引起多種病型,譬如病毒性關(guān)節(jié)炎、慢性呼吸道疾病、生長(zhǎng)遲緩和吸收不良綜合征,而且ARV感染會(huì)造成家禽的免疫抑制,加劇其它病原感染的風(fēng)險(xiǎn),給家禽養(yǎng)殖造成重大經(jīng)濟(jì)損失。p10是由ARVS1基因編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白,屬于I型跨膜蛋白,是ARV重要的毒力因子。其主要作用是在細(xì)胞膜上穿孔,破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜,促使細(xì)胞融合進(jìn)而有利于病毒擴(kuò)散,是引起合胞體形成的主要因素。然而,該蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)會(huì)被迅速降解。我們之前的研究發(fā)現(xiàn),ARVp10在細(xì)胞內(nèi)與溶酶體膜相關(guān)蛋白-1(Lysosome Associated Membrane Protein-1,LAMP-1)發(fā)生相互作用,并通過蛋白酶體途徑降解,而且LAMP-1在p10降解中發(fā)揮重要作用,然而LAMP-1如何在p10降解中發(fā)揮作用以及p10降解的分子機(jī)制尚不十分清楚。本研究利用免疫共沉淀和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)技術(shù),證實(shí)ARV p10和E3泛素連接酶Siah-1發(fā)生相互作用,進(jìn)一步通過分子生物學(xué)以及免疫沉淀檢測(cè)技術(shù),確定p10的N端胞外區(qū)(1aa～43aa)和Siah-1的C端底物結(jié)合區(qū)(141aa～282aa)相結(jié)合。在DF-1細(xì)胞中,過表達(dá)Siah-1可以促進(jìn)p10的降解,并且這種降解作用能被蛋白酶體抑制劑MG132抑制,說明p10降解依賴于泛素化蛋白酶體途徑。利用RNAi技術(shù)沉默內(nèi)源Siah-1表達(dá),使p10的表達(dá)量明顯提高。過表達(dá)Siah-1則促進(jìn)p10的泛素化水平,相反RNAi干擾Siah-1表達(dá)明顯抑制p10的泛素化,該結(jié)果證明Siah-1促使p10泛素化。同時(shí)通過體外泛素化實(shí)驗(yàn)也證明Siah-1促使p10泛素化。此外,在DF-1細(xì)胞中過表達(dá)Siah-1或以RNAi沉默Siah-1表達(dá)后感染ARV,檢測(cè)病毒復(fù)制情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Siah-1明顯抑制病毒增殖,相反干擾Siah-1的表達(dá)會(huì)使病毒增殖顯著增強(qiáng),并且細(xì)胞形成合胞體的數(shù)量也顯著提高,說明Siah-1在ARV增殖中發(fā)揮重要作用。在ARV感染的情況下,以p10單抗與細(xì)胞裂解物作免疫沉淀,結(jié)果表明p10單抗可以將p10蛋白、Siah-1以及LAMP-1同時(shí)沉淀下來,說明p10同時(shí)與Siah-1和LAMP-1相互作用,三者形成復(fù)合物。如果以RNAi干擾細(xì)胞內(nèi)源性LAMP-1表達(dá),p10與Siah-1的免疫共沉淀的量明顯減少,而且p10與Siah-1共定位的量也隨之減少,同時(shí)Siah-I促進(jìn)p1 0降解的能力也下降。該結(jié)果表明在ARV感染情況下,Siah-1通過與LAMP-1以及p10形成復(fù)合物引起p10泛素化,從而使p10通過蛋白酶體途徑降解。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞感染ARV后,E3泛素連接酶Siah-1通過泛素化ARV p10蛋白使其降解,抑制病毒增殖。在此過程中,LAMP-1招募Siah-1以及p10形成復(fù)合物,促進(jìn)Siah-1與p10結(jié)合,起到橋梁的作用,進(jìn)而使p10泛素化并通過蛋白酶體途徑降解,抑制ARV增殖。該研究結(jié)果揭示了 Siah-1在LAMP-1促進(jìn)p10降解中起關(guān)鍵作用,為進(jìn)一步研究ARV感染的致病機(jī)理提供重要參考。
【圖文】：

圖２－１邋ＰＣＲ擴(kuò)增}0／？－／基因逡逑Ｍ：分子量標(biāo)準(zhǔn)，？邋１：邋Ｓ／Ｍ－／ＰＣＲ產(chǎn)物．？邋２：陰性對(duì)照逡逑

圖２－２邋ＤＦ－１細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)的Ｓｉａｈ－１融合蛋白的表達(dá)檢測(cè)逡逑Ａ：邋ｐＣＭＶ－Ｍｙｃ或ｐＣＭＶ－Ｍｙｃ－Ｓｉａｈ－１邋轉(zhuǎn)染ＤＦ－丨細(xì)胞３６邋ｈ后，，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測(cè)蛋白表達(dá)：逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2655710