【摘要】：巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中扮演重要角色,保護(hù)機(jī)體抵抗病原體感染,調(diào)控組織炎癥發(fā)展。自噬包括細(xì)胞將其內(nèi)部錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、功能異�；蚪Y(jié)構(gòu)受損的細(xì)胞器及感染細(xì)胞的病原微生物等送至溶酶體進(jìn)行降解等過(guò)程,是細(xì)胞抵御病原體感染的重要機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺炎的主要病原體一金黃色葡萄球菌(S.aureus)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬。硒是機(jī)體所必需的一種重要微量元素,那么硒對(duì)S.aureus感染的巨噬細(xì)胞自噬又有何種影響,目前為止尚不明確。課題前期研究表明,硒可有效緩解S.aureus誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激,那么硒是否同樣能緩解S.aureus感染的巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激,有待于進(jìn)一步研究。鑒于此,本試驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7為研究對(duì)象,研究硒對(duì)S.aureus感染的巨噬細(xì)胞自噬及其相關(guān)信號(hào)通路(NF-κB和MAPK)的影響,同時(shí)探討硒對(duì)S.aureus感染的巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激及其相關(guān)信號(hào)通路(PI3K/Akt/mTOR)的影響。為研究硒對(duì)S.aureus感染的巨噬細(xì)胞自噬及其相關(guān)信號(hào)通路(NF-κB和MAPK)的影響,試驗(yàn)分為空白對(duì)照組、S.aurus感染組、補(bǔ)硒組和硒與.aurs共處理組。采用2μM的硒預(yù)孵育細(xì)胞12 h后,按MOI=1:1的比例接種S.aureus,45 min后終止處理進(jìn)行相關(guān)研究。采用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclinl、p62、LC3和Atg5以及MAPK與NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平;采用激光共聚焦法觀察細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白聚點(diǎn)熒光強(qiáng)度;采用透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,同時(shí)采用平板計(jì)數(shù)法研究S.aureus在巨噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌載量變化。結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,S.aureus感染巨噬細(xì)胞后,極顯著提高自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin1、LC3ⅡI和p62的表達(dá)量(p0.01),激光共聚焦顯微鏡可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)明顯的LC3蛋白熒光聚點(diǎn),透射電鏡可見(jiàn)包裹S.aureus的囊泡及自噬體,極顯著提高NF-κB和MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白磷酸化水平(p0.01);與S.aureus感染組相比,補(bǔ)硒后極顯著升高LC3Ⅱ表達(dá)量(p0.01),極顯著降低p62表達(dá)量(p0.01),激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白熒光聚點(diǎn)增多,透射電鏡可見(jiàn)包裹S.aureus的囊泡和自噬體,極顯著降低NF-κB和MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白磷酸化水平(p0.01);同時(shí),與S aureus感染組相比,補(bǔ)硒后,在1 h、2 h和3 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌載量顯著或極顯著降低(p0.05或p0.01)。結(jié)果表明,硒能促進(jìn)S.aureus感染的RAW264.7 巨噬細(xì)胞自噬,且能緩解自噬流阻滯,有利于巨噬細(xì)胞對(duì)S.aureus的清除,抑制胞內(nèi)菌的增殖,并能顯著抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平。為研究S.aureus感染巨噬細(xì)胞后,硒對(duì)巨噬細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及其氧化損傷的影響,細(xì)胞處理同上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western Blot檢測(cè)細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ROS水平和線粒體膜電位的變化,比色法檢測(cè)細(xì)胞T-SOD、CAT和GSH-Px的活性及MDA與T-AOC的水平。結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,S.aureus感染后極顯著提高細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平(p0.01);細(xì)胞內(nèi)的ROS水平極顯著升高(p0.01),細(xì)胞的線粒體膜電位極顯著降低(p0.01);CAT、T-SOD、GSH-Px的活性均極顯著下降(p0.01),MDA含量升高,T-AOC降低,差異均極顯著(p0.01);與S.aureus感染組相比,補(bǔ)硒后極顯著降低細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平(p0.01),細(xì)胞內(nèi)的ROS水平極顯著降低(p0.01),細(xì)胞的線粒體膜電位顯著上升(p0.05),CAT、T-SOD和GSH-Px的活性均極顯著上升(p0.01),MDA含量降低,T-AOC升高,差異均極顯著(p0.01)。結(jié)果表明,硒能顯著提高S.aureus感染的RAW264.7細(xì)胞的抗氧化酶活性,降低ROS水平和MDA的生成,同時(shí)提高線粒體膜電位水平,并可通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的蛋白表達(dá),提高細(xì)胞的抗氧化能力。綜上所述,硒可通過(guò)促進(jìn)RAW264.7自噬,緩解自噬流的阻滯,抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白,降低炎癥反應(yīng),同時(shí)抑制PI3K/Akt/mTOR,提高細(xì)胞的抗氧化能力,穩(wěn)定線粒體膜電位,減少ROS產(chǎn)生,緩解S.aurus導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。該研究為臨床奶牛乳腺炎的防治提供了新的思路和方法。
【圖文】：

圖１－１硒對(duì)Ｓ．ａｗｒｅｉｗ感染的ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白表徸的影響逡逑注：‘‘＊＊”表示與空白對(duì)照組相比，差異極顯著（／Ｋ０．０１），邋“＃�！北硎九cＳ．邋ａｗｒａ？感染組相比，差異極顯逡逑著（戶＜０．０１）；邋Ａ：邋Ｂｅｃｌｉｎｌ表達(dá)量，Ｂ：邋ｐ６２表達(dá)量，Ｃ：邋Ａｔｇ５表達(dá)量，Ｄ：邋ＬＣ３ＩＩ表達(dá)量。逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｓｅｌｅｎｉｕｍ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｋｅｙ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ邋ｉｎ邋ＲＡＷ２６４．７邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｓ．逡逑ａｕｒｅｕｓ．逡逑Ｎｏｔｅ：邐／？＜０．０１，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，邐ｐ＜０．０＼，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｌｉ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ｇｒｏｕｐ；邋Ａ：邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑ｏｆ邋Ｂｅｃｌｉｎｌ，邋Ｂ：邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐ６２，邋Ｃ：邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｔｇ５，邋Ｄ：邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＬＣ３ＩＩ．逡逑

ｌ＿逡逑Ｃｏｎ邐Ｓ．ａｕｒｅｕｓ邐Ｓｅ邐Ｓ，ａｕｒｅｕｓ＋Ｓｅ邐Ｃｏｎ邐Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邐Ｓｅ邐Ｓ．ａｕｒｅｔｔｓ＾Ｓｅ逡逑圖１－１硒對(duì)Ｓ．ａｗｒｅｉｗ感染的ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白表徸的影響逡逑注：‘‘＊＊”表示與空白對(duì)照組相比，差異極顯著（／Ｋ０．０１），邋“＃�！北硎九cＳ．邋ａｗｒａ？感染組相比，差異極顯逡逑著（戶＜０．０１）；邋Ａ：邋Ｂｅｃｌｉｎｌ表達(dá)量，Ｂ：邋ｐ６２表達(dá)量，Ｃ：邋Ａｔｇ５表達(dá)量，，Ｄ：邋ＬＣ３ＩＩ表達(dá)量。逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｓｅｌｅｎｉｕｍ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｋｅｙ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ邋ｉｎ邋ＲＡＷ２６４．７邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｓ．逡逑ａｕｒｅｕｓ．逡逑Ｎｏｔｅ：邐／？＜０．０１，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，邐ｐ＜０．０＼，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｌｉ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ｇｒｏｕｐ；邋Ａ：邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑ｏｆ邋Ｂｅｃｌｉｎｌ
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23

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本文編號(hào)：2654635