【摘要】：巨噬細胞在免疫系統(tǒng)中扮演重要角色,保護機體抵抗病原體感染,調控組織炎癥發(fā)展。自噬包括細胞將其內部錯誤折疊的蛋白質、功能異常或結構受損的細胞器及感染細胞的病原微生物等送至溶酶體進行降解等過程,是細胞抵御病原體感染的重要機制之一。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺炎的主要病原體一金黃色葡萄球菌(S.aureus)可誘導巨噬細胞發(fā)生自噬。硒是機體所必需的一種重要微量元素,那么硒對S.aureus感染的巨噬細胞自噬又有何種影響,目前為止尚不明確。課題前期研究表明,硒可有效緩解S.aureus誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化應激,那么硒是否同樣能緩解S.aureus感染的巨噬細胞氧化應激,有待于進一步研究。鑒于此,本試驗以小鼠巨噬細胞系RAW264.7為研究對象,研究硒對S.aureus感染的巨噬細胞自噬及其相關信號通路(NF-κB和MAPK)的影響,同時探討硒對S.aureus感染的巨噬細胞氧化應激及其相關信號通路(PI3K/Akt/mTOR)的影響。為研究硒對S.aureus感染的巨噬細胞自噬及其相關信號通路(NF-κB和MAPK)的影響,試驗分為空白對照組、S.aurus感染組、補硒組和硒與.aurs共處理組。采用2μM的硒預孵育細胞12 h后,按MOI=1:1的比例接種S.aureus,45 min后終止處理進行相關研究。采用Western Blot檢測細胞自噬相關蛋白Beclinl、p62、LC3和Atg5以及MAPK與NF-κB信號通路關鍵蛋白的表達水平;采用激光共聚焦法觀察細胞內LC3蛋白聚點熒光強度;采用透射電鏡觀察細胞超微結構的變化,同時采用平板計數(shù)法研究S.aureus在巨噬細胞內的細菌載量變化。結果顯示:與空白對照組相比,S.aureus感染巨噬細胞后,極顯著提高自噬相關蛋白Atg5、Beclin1、LC3ⅡI和p62的表達量(p0.01),激光共聚焦顯微鏡可見細胞內明顯的LC3蛋白熒光聚點,透射電鏡可見包裹S.aureus的囊泡及自噬體,極顯著提高NF-κB和MAPK信號通路的關鍵蛋白磷酸化水平(p0.01);與S.aureus感染組相比,補硒后極顯著升高LC3Ⅱ表達量(p0.01),極顯著降低p62表達量(p0.01),激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內LC3蛋白熒光聚點增多,透射電鏡可見包裹S.aureus的囊泡和自噬體,極顯著降低NF-κB和MAPK信號通路的關鍵蛋白磷酸化水平(p0.01);同時,與S aureus感染組相比,補硒后,在1 h、2 h和3 h時細胞內細菌載量顯著或極顯著降低(p0.05或p0.01)。結果表明,硒能促進S.aureus感染的RAW264.7 巨噬細胞自噬,且能緩解自噬流阻滯,有利于巨噬細胞對S.aureus的清除,抑制胞內菌的增殖,并能顯著抑制NF-κB和MAPK信號通路關鍵蛋白表達水平。為研究S.aureus感染巨噬細胞后,硒對巨噬細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路及其氧化損傷的影響,細胞處理同上進行后續(xù)實驗。Western Blot檢測細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達水平,流式細胞儀檢測細胞ROS水平和線粒體膜電位的變化,比色法檢測細胞T-SOD、CAT和GSH-Px的活性及MDA與T-AOC的水平。結果顯示:與空白對照組相比,S.aureus感染后極顯著提高細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平(p0.01);細胞內的ROS水平極顯著升高(p0.01),細胞的線粒體膜電位極顯著降低(p0.01);CAT、T-SOD、GSH-Px的活性均極顯著下降(p0.01),MDA含量升高,T-AOC降低,差異均極顯著(p0.01);與S.aureus感染組相比,補硒后極顯著降低細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平(p0.01),細胞內的ROS水平極顯著降低(p0.01),細胞的線粒體膜電位顯著上升(p0.05),CAT、T-SOD和GSH-Px的活性均極顯著上升(p0.01),MDA含量降低,T-AOC升高,差異均極顯著(p0.01)。結果表明,硒能顯著提高S.aureus感染的RAW264.7細胞的抗氧化酶活性,降低ROS水平和MDA的生成,同時提高線粒體膜電位水平,并可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的蛋白表達,提高細胞的抗氧化能力。綜上所述,硒可通過促進RAW264.7自噬,緩解自噬流的阻滯,抑制MAPK和NF-κB信號通路關鍵蛋白,降低炎癥反應,同時抑制PI3K/Akt/mTOR,提高細胞的抗氧化能力,穩(wěn)定線粒體膜電位,減少ROS產生,緩解S.aurus導致的細胞損傷。該研究為臨床奶牛乳腺炎的防治提供了新的思路和方法。
【圖文】：

圖１－１硒對Ｓ．ａｗｒｅｉｗ感染的ＲＡＷ２６４．７細胞自噬關鍵蛋白表徸的影響逡逑注：‘‘＊＊”表示與空白對照組相比，差異極顯著（／Ｋ０．０１），邋“＃�！北硎九cＳ．邋ａｗｒａ？感染組相比，差異極顯逡逑著（戶＜０．０１）；邋Ａ：邋Ｂｅｃｌｉｎｌ表達量，Ｂ：邋ｐ６２表達量，Ｃ：邋Ａｔｇ５表達量，Ｄ：邋ＬＣ３ＩＩ表達量。逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｓｅｌｅｎｉｕｍ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｋｅｙ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ邋ｉｎ邋ＲＡＷ２６４．７邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｓ．逡逑ａｕｒｅｕｓ．逡逑Ｎｏｔｅ：邐／？＜０．０１，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，邐ｐ＜０．０＼，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｌｉ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ｇｒｏｕｐ；邋Ａ：邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑ｏｆ邋Ｂｅｃｌｉｎｌ，邋Ｂ：邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐ６２，邋Ｃ：邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｔｇ５，邋Ｄ：邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＬＣ３ＩＩ．逡逑

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【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

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