【摘要】：雞馬立克氏病(Marek's disease,MD)是由馬立克氏病病毒(MDV)引起的一種雞的惡性淋巴增生性腫瘤疾病,嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。MDV有3個血清型,其中1型為致瘤型,主要破壞T細胞,可引起免疫抑制。國內外學者對MDV的致瘤機制做了大量的研究,但具體的機制還不是很清楚。外泌體是一類直徑介于30nm-150nm之間的由細胞分泌的細胞外小囊泡,可攜帶蛋白、microRNA(miRNA)等成分,在細胞間物質交換和信號傳遞中起重要作用。miRNA是一種長度僅有19-25nt左右的非編碼小RNA,其本身的生產加工成熟機制及功能已獲得巨大的研究成果。特別是在人類癌癥疾病中,miRNA在癌癥疾病中不僅可以作為癌基因,也可作為腫瘤抑制因子,還可作為癌癥標志物。其靶向腫瘤抑制因子時,當其上調可抑制靶向的抑癌基因,促進癌癥的發(fā)展。近幾年研究也發(fā)現(xiàn),外泌體可通過直接或間接的作用影響腫瘤的發(fā)展及腫瘤細胞的遷移。PTEN是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的抑癌基因,是P13K/Akt/mTOR信號通路中的一種負調節(jié)因子,多年來的研究發(fā)現(xiàn),PTEN影響腫瘤細胞的分化、增殖、生長、遷移及凋亡。PTEN在人類疾病的研究中十分常見,但是對于禽類癌癥的研究卻極其稀少。那么MD作為禽類腫瘤的模型,在MDV感染過程中,外泌體及其組分在MD發(fā)生發(fā)展中起什么作用,靶向PTEN的miRNA有哪些,又是如何作用的呢?本研究以MDV為研究對象,分別從感染了馬立克強毒株MD5的雞胚成纖維細胞(CEF)和未感染的CEF培養(yǎng)上清中分離純化外泌體,質譜(MS)和Western blot分析表明,MDV感染的細胞外泌體中含有MDV的病毒蛋白VP22,PP38,gB等成分,細胞增殖試驗發(fā)現(xiàn),外泌體可以刺激雞脾細胞增殖;高劑量的細胞外泌體可以誘導淋巴細胞IFN-y分泌;流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)MDV感染的細胞外泌體抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞。外泌體高通量測序結果表明,MDV感染與未感染病毒細胞上清外泌體中相比有26個miRNA上調,257個miRNA下調,其中預測靶向PTEN的miRNA有3個,分別為miR-74、miR-72、miR-43,進一步試驗發(fā)現(xiàn)miR-43可能靶向PTEN。過表達miR-43后,PTEN的mRNA水平下調,抑制細胞凋亡,促進細胞增殖,為接下來確定miR-43與PTEN的靶向關系奠定了基礎,也為MDV的致瘤機制研究提供了新的方向。
【圖文】：

已知細胞培養(yǎng)基中的外泌體較于血液中的外泌體而言偏少，且不同細胞分泌的外逡逑泌體，其大小可能會不同，但是從透射電鏡中觀察其形態(tài)，都會有類似“茶杯托”的形逡逑狀。圖１－１Ａ電鏡顯示，ＭＤＶ感染和未感染的ＣＥＦ細胞上清中可觀察到典型的杯狀形逡逑態(tài)的囊泡，大小約３０－１００ｎｍ。感染組的細胞上清所提取的外泌體接種ＣＥＦ，未產生細逡逑胞病變，表明所提取的外泌體中不含ＭＤＶ病毒粒子，如圖１－１Ｂ。逡逑３．２邋ＢＣＡ測定外泌體濃度逡逑本試驗運用ＢＣＡ邋（碧云天）檢測試劑盒測定出所提取的外泌體的濃度，根據(jù)公式計逡逑算正常ＣＥＦ提取的外泌體濃度約為１．０２ｍｇ／ｍｌ，邋ＭＤＶ感染的ＣＥＦ提取的外泌體濃度為０．９８逡逑ｍｇ／ｍｌ0逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｘｏｓｏｍｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｍａｒｋｅｒｓ逡逑驗采用的是差速離心法提取細胞上清中的外泌體，為了驗證提取的外ｌｏｔ方法檢測外泌體表面標志物Ｈｓｐ７０，邋ＣＤ６３邋ａｎｄ邋ＣＤ９。圖１－２顯示，所能檢測到外泌體的標志蛋白ＨＳＰ７０、ＣＤ９和ＣＤ６１。逡逑感染對ＣＥＦ細胞外泌體蛋白組成的影響逡逑一步鑒定來自不同ＣＥＦ來源的外泌體蛋白組成，通過質譜法分析外泌如圖１－３所示。通過比對多肽序列與雞和ＭＤＶ蛋白質文庫，發(fā)現(xiàn)ｍｄ５正常ＣＥＦ外泌體相比有２８９種表達差異的蛋白，其中，１４７種上調（ｒａｔｉｏ調（ｒａｔｉｏ＜０．５）。且ｍｄ５感染的外泌體中包含２０種ＭＤＶ蛋白，包括特，糖蛋白ｇｂ，，被膜蛋白ＶＰ２２等，ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ結果與ＭＳ—致（圖１－４
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.31

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本文編號：2654585