【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是一種豬源性疾病,可以破壞5~12周齡仔豬的免疫系統(tǒng),使其相繼因營養(yǎng)缺失或多種并發(fā)癥而導致死亡。豬等偶蹄目動物在自然狀態(tài)下感染口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)后,經(jīng)常表現(xiàn)出的病理狀態(tài)為唇、蹄部皮膚發(fā)生糜爛并多伴有大量水泡生成,使其進食困難,阻礙其生長。目前這兩種疾病都對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的危害,現(xiàn)如今對豬進行疫苗免疫是我國普遍通用的預防手段。但是,針對這兩種動物疫病的傳統(tǒng)疫苗仍存在很多不足和需要改進的方面,因此仍需依靠基因工程等方法研制出新型的動物疫苗來控制這兩種疾病的傳播。PCV2 Cap蛋白是PCV2的主要結構性蛋白,能介導病毒的識別和入侵,這種分布在病毒表面的蛋白質與病毒的病原性息息相關。而VP1蛋白是FMDV的主要結構性蛋白,這種蛋白對FMDV的血清型差異以及免疫原性的隔離都有著關鍵性的影響,同時能夠被宿主細胞表面的受體識別并與之結合。因此,Cap和VP1通常被作為針對PCV2和FMDV基因工程疫苗的關鍵性靶蛋白。目前,已有多篇研究表明CD40配體(CD40 Ligand,CD40L)可以作為分子佐劑增強疫苗的免疫效果。因此,豬CD40L可以成為增強這兩種疾病疫苗的分子佐劑,提高其免疫效果。本研究將Cap和VP1這兩種蛋白與豬CD40L進行融合表達并利用桿狀病毒表達系統(tǒng),將融合蛋白展示在桿狀病毒表面,構建了3種重組桿狀病毒:rvAc-Cap、rvAc-VP1和rvAc-Cap-VP1。通過SDS-PAGE電泳分析和Western blotting檢測這3種重組桿狀病毒感染的sf9細胞證明3種融合蛋白成功表達,大小分別約為146 kDa、138 kDa和165 kDa,符合預期理論值。并通過間接免疫熒光和免疫電鏡驗證了融合蛋白成功展示在了被感染細胞的細胞膜表面和重組桿狀病毒的囊膜表面。以1×10~8 pfu/只的劑量用純化的重組桿狀病毒顆粒作為活載體疫苗對BALB/c小鼠進行皮下免疫接種,通過間接ELISA檢測小鼠血清中Cap和VP1的抗體濃度,證明表面展示有Cap和VP1的重組桿狀病毒能激發(fā)小鼠產生較高的抗體水平,與PCV2和FMDV商品化疫苗免疫組的抗體濃度差異不顯著(P0.05),檢測小鼠血清中IL-4的濃度,證明重組桿狀病毒能夠刺激小鼠的IL-4分泌水平升高。為了進一步探究其免疫效果,將rvAc-Cap-VP1以1×10~8 pfu/只的劑量通過霧化免疫的方法免疫小鼠,間接ELISA檢測表明小鼠血清中Cap和VP1的抗體濃度與PBS組相比顯著升高(P0.05),rvAc-Cap-VP1霧化免疫組的IL-4分泌水平升高。上述實驗結果表明,表面展示有Cap蛋白和VP1蛋白的rvAc-Cap-VP1重組桿狀病毒通過皮下注射免疫和霧化免疫均能夠激發(fā)小鼠產生PCV2和FMDV的體液免疫應答以及細胞免疫應答,擁有良好的免疫原性。本研究將Cap和VP1展示在桿狀病毒表面,并初步探索了rvAc-Cap-VP1重組桿狀病毒在小鼠機體上的免疫效果,為進一步研制和生產PCV2、FMDV二聯(lián)活載體疫苗建立了良好的理論基礎。
【圖文】：

床《局刈楸澩?PCV2 Cap 與 FMDV VP1 蛋白及免疫研究2圖1.1 豬圓環(huán)病毒2型的衣殼蛋白結構[14]Fig. 1.1 Structure of the Capsids of PCV2根據(jù)分子流行病學的分析顯示，ORF2相對于ORF1和ORF3等其他的基因來說，具有更高的可變異性，并且ORF2的多變性與病毒的毒力和病毒復制也有著重要的關系。PCV2可通過Cap蛋白與病毒結合受體肝素硫酸鹽和軟骨素硫酸鹽B黏多糖的相互作用來介導病毒侵入宿主體內[15]。因此，基于ORF2的多態(tài)性，在PCV2的ORF2區(qū)域內具有特定的等位基因。PCV2毒力決定因子的研究結果也表明，PCV2的Cap蛋白中氨基酸的置換會增強PCV2在體外的增殖能力，但是病毒的毒力和侵染細胞的能力會大大降低[16, 17]。作為PCV2主要的免疫原性蛋白

2.1 FMDV 的結構蛋白質及功能經(jīng)過病毒結構解析后發(fā)現(xiàn)，，F(xiàn)MDV的病毒粒子在空間上呈規(guī)則的球形，如圖1.2[28]所示，病毒表面的衣殼由60個不對稱的原體緊密包裹而成，結構蛋白在病毒表面形成一個規(guī)則對稱的二十面體形狀。圖1.2 口蹄疫病毒的二十面體衣殼蛋白結構示意圖[28]Fig. 1.2 Schematic depiction of the FMDV icosahedral capsid通過對比不同血清型的FMDV結構，發(fā)現(xiàn)結構蛋白中存在差異的構象主要集中在VP1~ 3的環(huán)狀區(qū)域和羧基端，而這些導致不同血清型差異化的結構全都暴露在病毒衣殼的外表面[29]。
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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本文編號：2654343