【摘要】：牦牛作為青藏高原重要的遺傳資源,是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的重要經(jīng)濟(jì)支柱。為適應(yīng)高原惡劣生態(tài)環(huán)境,牦牛在解剖學(xué)和生理學(xué)上均表現(xiàn)出一些適應(yīng)性進(jìn)化特性。腦部是機(jī)體耗氧量最大的組織,探索并挖掘腦組織在牦牛低氧適應(yīng)性中的作用至關(guān)重要。本研究通過(guò)RNA-Seq技術(shù)分別對(duì)類烏齊牦牛、西藏牛、三江牛的大腦和小腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得3種牛群大腦和小腦組織間的差異表達(dá)情況,篩選與低氧適應(yīng)性相關(guān)的候選基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,最后隨機(jī)選取部分候選基因進(jìn)行熒光定量驗(yàn)證。結(jié)果如下:1.18個(gè)樣本獲得reads堿基總數(shù)在11,893~16,422 Mbp之間,過(guò)濾后GC含量為50%左右,Q30值為94.75%~96.32%,與參考基因組比對(duì)后比對(duì)率為90.88%~93.81%。2.類烏齊牦牛大腦組織共篩選獲得mRNA轉(zhuǎn)錄本33,282個(gè),其中新轉(zhuǎn)錄本12,499個(gè),已知轉(zhuǎn)錄本20,783個(gè),共篩選到lncRNA轉(zhuǎn)錄本2,969個(gè),其中新轉(zhuǎn)錄本2,703個(gè),已知轉(zhuǎn)錄本266個(gè);小腦組織共篩選到mRNA轉(zhuǎn)錄本33,552個(gè),其中已知轉(zhuǎn)錄本21,008個(gè),新轉(zhuǎn)錄本12,544個(gè),lncRNA轉(zhuǎn)錄本3,027個(gè),其中新轉(zhuǎn)錄本2,750個(gè),已知轉(zhuǎn)錄本277個(gè)。西藏牛的大腦組織共篩選獲得mRNA轉(zhuǎn)錄本57,158個(gè),其中新轉(zhuǎn)錄本11,362個(gè),已知轉(zhuǎn)錄本45,796個(gè),獲得lncRNA轉(zhuǎn)錄本5,404個(gè),其中新轉(zhuǎn)錄本2,014個(gè),已知轉(zhuǎn)錄本3,390個(gè);小腦組織中共篩選獲得mRNA轉(zhuǎn)錄本56,600個(gè),其中已知轉(zhuǎn)錄本45,319個(gè),新轉(zhuǎn)錄本11,281個(gè),獲得lncRNA轉(zhuǎn)錄本5,295個(gè),其中新轉(zhuǎn)錄本2,015個(gè),已知轉(zhuǎn)錄本3,280個(gè)。三江牛大腦組織共篩選獲得mRNA轉(zhuǎn)錄本56,477個(gè),其中已知轉(zhuǎn)錄本45,269個(gè),新轉(zhuǎn)錄本11,208個(gè),獲得lncRNA轉(zhuǎn)錄本5,457個(gè),已知轉(zhuǎn)錄本3,393個(gè),新轉(zhuǎn)錄本2,064個(gè);小腦組織中共篩選獲得mRNA轉(zhuǎn)錄本55,389個(gè),其中已知轉(zhuǎn)錄本44,503個(gè),新轉(zhuǎn)錄本10,886個(gè),獲得lncRNA轉(zhuǎn)錄本4,830個(gè),其中新轉(zhuǎn)錄本1,781個(gè),已知轉(zhuǎn)錄本3,049個(gè)。類烏齊牦牛大腦和小腦組織中共篩選獲得2,912個(gè)新lncRNAs,13,162個(gè)新的mRNAs;普通牛(西藏牛和三江牛)中篩選獲得2,439個(gè)新lncRNAs,13,585個(gè)新mRNAs。3.主成分分析結(jié)果顯示:類烏齊牦牛mRNA、lncRNA的第一主成分能夠?qū)⒋竽X小腦組織進(jìn)行區(qū)分,第二主成分能夠?qū)⒉煌瑐�(gè)體進(jìn)行區(qū)分。而三江牛和西藏牛mRNA、lncRNA的第一主成分雖然能將大腦小腦組織進(jìn)行區(qū)分,但第二主成分未能完全區(qū)分西藏牛和三江牛個(gè)體,表明黃牛組織間差異高于種群間差異。此外,不同組織間lncRNA、mRNA表達(dá)水平存在差異,其中類烏齊牦牛大腦與小腦組織間,共發(fā)現(xiàn)50個(gè)差異lncRNAs,424個(gè)差異mRNAs;三江牛大腦與小腦組織間,共發(fā)現(xiàn)329個(gè)差異lncRNAs,2,326個(gè)差異mRNAs;西藏牛大腦與小腦組織間,共發(fā)現(xiàn)2個(gè)差異lncRNAs,89個(gè)差異mRNAs。西藏牛組織間差異基因數(shù)最少,類烏齊牦牛組織間差異基因數(shù)介于兩者之間。三江牛與西藏牛大腦組織間共發(fā)現(xiàn)42個(gè)差異lncRNAs,374個(gè)差異mRNAs;小腦組織間,存在263個(gè)差異lncRNAs,1,807個(gè)差異mRNAs。西藏牛和三江牛大腦間差異基因數(shù)目較小腦組織少。4.類烏齊牦牛、西藏牛、三江牛腦組織差異表達(dá)基因富集到與低氧適應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路,主要包括神經(jīng)活性-受體相互作用、鈣信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、胰腺分泌物、胰島素分泌、腎素分泌、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、血管平滑肌收縮、肌醇磷酸代謝、VEGF信號(hào)通路、代謝途徑、p53信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。此外,與大腦組織相比,小腦組織差異基因富集到更多低氧適應(yīng)相關(guān)的通路。5.類烏齊牦牛和普通牛組(西藏牛和三江牛)lncRNA靶基因顯著富集的信號(hào)通路存在差異。類烏齊牦牛lncRNA靶基因富集的生物學(xué)過(guò)程有跨質(zhì)膜氨基酸入口、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、大分子代謝調(diào)節(jié)過(guò)程等條目;細(xì)胞組分上有膜結(jié)合的細(xì)胞器、細(xì)胞器膜、立體纖維素和磷脂酰肌醇-3-激酶復(fù)合物等條目;分子功能上有L-鳥氨酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、高親和力堿性氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合等條目。信號(hào)通路顯著富集在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)(Q0.05)。普通牛組lncRNA靶基因富集的生物學(xué)過(guò)程有神經(jīng)肽分解代謝過(guò)程、調(diào)節(jié)血液中的血管緊張素水平、血管緊張素代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)等條目;細(xì)胞組分上有動(dòng)力蛋白復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄抑制因子復(fù)合物、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器等條目;分子功能上有磷酯酰肌醇二磷酸磷酸酶活性、連接酶活性等條目;信號(hào)通路顯著富集在調(diào)節(jié)自噬、AMPK信號(hào)通路、脂肪消化吸收等26條信號(hào)通路(Q0.05)。6.在與低氧相關(guān)的信號(hào)通路中,共篩選獲得91個(gè)與低氧相關(guān)的候選基因,并分析了其在不同組織的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)部分基因的表達(dá)在組織間或種群間存在顯著差異(P0.05)。從中隨機(jī)挑選8個(gè)基因,通過(guò)qPCR技術(shù)驗(yàn)證了ADRA1A、MYLK、TNNC1、PRKCH、ACOX1、COX7C、INPP4、TPM3等基因在不同組織中的表達(dá)情況,結(jié)果與RNA-seq測(cè)序結(jié)果一致。本研究基于高通量測(cè)序結(jié)果,篩選類烏齊牦牛、西藏牛及三江牛lncRNA、mRNA的差異表達(dá)基因及相關(guān)信號(hào)通路,為探索牦牛低氧適應(yīng)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

/www.mirbase.org/）；GO 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://amigo.geneontology.org）http://www.kegg.jp）；GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/rfam.xfam.org/）。驗(yàn)方法驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析流程究中，牦牛所用參考基因組為 BosGru-2.0，西藏牛、三江牛參S-UCD1.2，每個(gè)樣本 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾得到 creads 與參考基因組比對(duì)，利用 Cufflinks 軟件重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，得到轉(zhuǎn)錄本。結(jié)合 CPC、CNCI 等軟件對(duì)新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行編碼能力預(yù)測(cè)的 lncRNA，然后分別對(duì)樣本中 mRNA、lncRNA 進(jìn)行表達(dá) lncRNA-mRNA 聯(lián)合分析。其分析流程如圖 1：

圖 2 三個(gè)種群樣本總 RNA 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Total RNAquality test results of three population samples
【學(xué)位授予單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S823.85

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本文編號(hào)：2654314