【摘要】：miRNA是一類內(nèi)源性且具有調(diào)控功能的小分子非編碼RNA,可以與靶基因3’非翻譯區(qū)進(jìn)行堿基配對(duì)結(jié)合來(lái)降解mRNA或者抑制其翻譯。研究發(fā)現(xiàn)精子中的RNAs,尤其是miRNAs、tsRNA、以及siRNAs對(duì)合子基因的轉(zhuǎn)換、表觀重編程、受精胚胎發(fā)育以及其后代表型等都有著重要的影響。本研究根據(jù)本課題組前期構(gòu)建的牛成熟精子、MII期卵母細(xì)胞和牛成纖維細(xì)胞的miRNAs文庫(kù),結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和生物信息學(xué)分析,初步篩選出精子高表達(dá)的miR-183,預(yù)測(cè)其可能是對(duì)早期胚胎發(fā)育起重要作用的一個(gè)miRNA。通過(guò)單細(xì)胞q-PCR方法精確驗(yàn)證miR-183在精子中高表達(dá)。對(duì)miR-183的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)方法分析,并通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和q-PCR確定了其在細(xì)胞骨架調(diào)控和凋亡通路上的靶基因:EZRIN、PPP2CA和PDCD6。將miR-183 inhibitor mimic、control mimic通過(guò)顯微注射的方法注入受精卵原核期胚胎,發(fā)現(xiàn)miR-183 inhibitor組原核期紡錘體正常率較對(duì)照組顯著降低(57.10%vs 76.07%,P0.05),且囊胚率、囊胚細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組(30.33%vs 37.33%;106.6 vs 115.2,P0.05)。對(duì)注射后體外受精各時(shí)期胚胎進(jìn)行q-PCR,發(fā)現(xiàn)從原核期一直到4-細(xì)胞期,miR-183 inhibitor組的EZRIN、PPP2CA、PDCD6的基因表達(dá)水平顯高于NC組,證明了miR-183對(duì)靶基因的調(diào)控作用持續(xù)到4-細(xì)胞時(shí)期;對(duì)各組囊胚凋亡率進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)miR-183 inhibitor組的囊胚凋亡率顯著高于對(duì)照組(8.2%vs 4.8%,P0.05)。綜上所述,通過(guò)生物信息學(xué)方法結(jié)合分子水平上驗(yàn)證,找到miR-183在受精后胚胎中的靶基因:EZRIN、PPP2CA、PDCD6。通過(guò)功能缺失實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-183對(duì)受精后胚胎的紡錘體形成、囊胚發(fā)育及胚胎質(zhì)量具有顯著影響。
【圖文】：

使用前漩渦重懸磁珠，樣品加入 40 μL動(dòng) 10 min 使其均勻混合，磁鐵架吸附分離磁性 0 μL 的 80%乙醇，，漩渦儀均勻混合，繼續(xù)用磁鐵in，加入 20 μL 的 EB 緩沖液，1100 rpm 5 min，分加入 9 μL 預(yù)擴(kuò)增試劑，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增程序，預(yù)擴(kuò)增7℃孵育 30 min，95℃孵育 5 min，加入 100 μL 水反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)iRBase 網(wǎng)站上找到 bta-miR-183 的成熟序列。序列所有的 U 改為 T，堿基替換后的序列就是 b在 IVF 胚胎中的表達(dá)

靶基因報(bào)告載體為模板，經(jīng)過(guò)重疊延伸PCR構(gòu)建psi-mut-EZRIN、psi-mut-t-PPP2CA 靶基因突變載體。圖 4-1 所示，1-4 是突變 PPP2CA 結(jié)合位點(diǎn)的-8 是突變 EZRIN 結(jié)合位點(diǎn)的 3’UTR 序列；9-11 是突變 PDCD6 結(jié)合位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果正確，靶基因 EZRIN、PDCD6、PPP2CA 的突變載體構(gòu)建成功圖 4-1 PCR 擴(kuò)增靶基因突變序列Fig 4-1 PCR amplication of the the target gene mutant sequenceLR 檢測(cè)結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 童彬彬;Ezrin對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 唐超;Ppp2ca基因的失活對(duì)雄性小鼠精子發(fā)生的影響及海馬中特異性敲除Dicer1蛋白的小鼠的構(gòu)建和表型[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2654044