【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原。臨床發(fā)現(xiàn)PCV2感染的仔豬常伴隨其他病原的共同感染,但PCV2感染動(dòng)物對(duì)多種病原易感的免疫機(jī)制尚不清楚。作為一種重要的促炎性細(xì)胞因子,白細(xì)胞介素-12(interleukin-12,IL-12)在機(jī)體抵抗病原微生物感染的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。IL-12p40在PCV2感染仔豬脾臟和淋巴結(jié)等器官中的表達(dá)能力顯著下調(diào),接種PCV2的仔豬肺泡巨噬細(xì)胞IL-12p40的表達(dá)能力亦降低。但PCV2感染仔豬后通過何種機(jī)制導(dǎo)致免疫器官中IL-12p40表達(dá)受到抑制,目前并不清楚。本試驗(yàn)擬將PCV1、PCV2的Rep、Cap蛋白互換,構(gòu)建PCV1-Rep2、PCV1-Cap2、PCV2-Rep1和PCV2-Cap1四種突變毒株,將其分別轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后,連續(xù)傳代5次,獲得4株P(guān)CV突變毒株,為后續(xù)研究提供材料。之后檢測Mock、PCV1和PCV2感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞中LPS/IFN-γ或LPS/R848誘導(dǎo)IL-12p40表達(dá)的水平,再通過表達(dá)PCV2 Rep和Cap的重組腺病毒以及PCV突變毒株感染豬肺泡巨噬細(xì)胞,明確PCV2抑制IL-12p40表達(dá)的關(guān)鍵組分,確定參與PCV2感染抑制細(xì)胞中IL-12p40表達(dá)的關(guān)鍵信號(hào)通路和miRNAs,明確PCV2感染抑制病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞IL-12p40表達(dá)的分子機(jī)制,為進(jìn)一步闡明PCV2感染導(dǎo)致的免疫抑制機(jī)制提供理論依據(jù)。研究取得如下結(jié)果。1.通過嵌合載體構(gòu)建方法,將PCV1的Rep1和Cap1分別替換為PCV2的Rep2和Cap2;將PCV2的Rep2和Cap2分別替換為PCV1的Rep1和Cap1,成功構(gòu)建了PCV1-Rep2、PCV2-Cap1、PCV1-Cap2和PCV2-Rep1四種PCV的突變毒株。2.分別用Mock、PCV1、PCV2體內(nèi)或體外感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后,LPS/IFN-γ或LPS/R848刺激細(xì)胞,ELISA和Q-PCR檢測IL-12p40表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與Mock或PCV1感染組相比,PCV2體內(nèi)或體外感染豬肺泡巨噬細(xì)胞能顯著抑制由LPS/IFN-γ或LPS/R848誘導(dǎo)的IL-12p40表達(dá)。3.分別用表達(dá)PCV2 Rep、Cap的重組腺病毒rAd-Rep、rAd-Cap感染豬肺泡巨噬細(xì)胞,再以LPS/IFN-γ或LPS/R848刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞,結(jié)果顯示,Rep和Cap在細(xì)胞水平均可顯著抑制由LPS/IFN-γ或LPS/R848誘導(dǎo)的IL-12p40表達(dá),但相對(duì)于Rep,Cap蛋白抑制作用更顯著;同時(shí),以PCV或PCV突變毒株感染豬肺泡巨噬細(xì)胞,結(jié)果顯示突變體PCV1-Cap2和PCV2-Rep1感染后顯著抑制了由LPS/IFN-γ和LPS/R848誘導(dǎo)的IL-12p40表達(dá)。此結(jié)果說明,相對(duì)于Rep蛋白,PCV2的Cap蛋白更強(qiáng)烈地抑制IL-12p40表達(dá)。4.PCV2分別感染野生型(gC1qR~(+/+))和gC1qR基因敲除(gC1qR~(-/-))豬肺泡巨噬細(xì)胞,Mock組顯示gC1qR基因缺失未影響LPS/IFN-γ或LPS/R848誘導(dǎo)的IL-12p40的表達(dá)。PCV2感染gC1qR基因敲除(gC1qR~(-/-))豬肺泡巨噬細(xì)胞,LPS/IFN-γ或LPS/R848誘導(dǎo)的IL-12p40的表達(dá)未被顯著抑制,表明gC1qR參與PCV2抑制IL-12p40產(chǎn)生的過程。5.分別用Akt1、p38 MAPK和ERK1特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,感染PCV2后再以LPS/IFN-γ或LPS/R848刺激,結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染Akt1和p38 MAPK特異性siRNA的細(xì)胞中,PCV2對(duì)IL-12p40的抑制作用被顯著降低,而轉(zhuǎn)染ERK1特異性siRNA的細(xì)胞中,IL-12p40的表達(dá)未見顯著變化。6.PCV2感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞,Q-PCR檢測可能參與調(diào)控豬IL-12p40表達(dá)的mi RNA,結(jié)果顯示在PCV2感染的PAMs中,miR-23a、miR-23b、miR-29a和miR-29b顯著上調(diào)。重組腺病毒rAd-Cap可以上調(diào)這些miRNA表達(dá),而rAd-Rep不能,同時(shí)gC1qR基因敲除(gC1qR~(-/-))的豬肺泡巨噬細(xì)胞中這些miRNA的上調(diào)被抑制,抑制Akt1的細(xì)胞中PCV2誘導(dǎo)的miR-23a、mi R-23b和miR-29b的表達(dá)被抑制,抑制p38 MAPK的細(xì)胞中PCV2誘導(dǎo)的miR-29a和mi R-29b的表達(dá)被抑制,此外,抑制ERK1對(duì)PCV2誘導(dǎo)的mi R-23a、mi R-23b、miR-29a和miR-29b上調(diào)無顯著影響。7.分別用mi R-23a、miR-23b、mi R-29a和miR-29b的mimics或特異性抑制劑處理細(xì)胞,PCV2感染后用LPS/IFN-γ刺激,ELISA檢測IL-12p40的分泌,結(jié)果顯示,mimics預(yù)處理細(xì)胞后,LPS/IFN-γ或LPS/R848誘導(dǎo)的IL-12p40在蛋白水平均顯著降低,然而,與對(duì)照組相比,只有miR-29a和miR-29b mimics能顯著降低IL-12p40的mRNA水平;抑制mi R-23a和miR-29b可以顯著逆轉(zhuǎn)PCV2對(duì)IL-12p40在蛋白水平的抑制,抑制mi R-29b的表達(dá)能顯著增加細(xì)胞中IL-12p40 mRNA水平,同時(shí),與單獨(dú)抑制miR-23a或miR-29b相比,同時(shí)抑制miR-23a和miR-29b或同時(shí)抑制4種miRNA(miR-23a、mi R-23b、miR-29a和miR-29b)能更顯著地增加PCV2感染的PAMs中LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的IL-12p40表達(dá),但二者之間無顯著差異。綜上所述,本研究工作獲得了4個(gè)PCV突變毒株P(guān)CV1-Rep2、PCV1-Cap2、PCV2-Rep1和PCV2-Cap1。明確了PCV2通過其Cap與宿主gC1qR相互作用激活的Akt1和p38 MAPK信號(hào)通路上調(diào)mi R-23a和miR-29b表達(dá),進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平抑制病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)的豬肺泡巨噬細(xì)胞IL-12p40表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)將對(duì)深入認(rèn)識(shí)PCV2的免疫抑制機(jī)制具有重大意義。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651

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本文編號(hào)：2653896