【摘要】：犬新孢子蟲(Neospora caninum,N.caninum),簡(jiǎn)稱新孢子蟲,隸屬于頂復(fù)亞門,孢子蟲綱,是一種嚴(yán)格的胞內(nèi)寄生性原蟲,引起新孢子蟲病(Neosporiasis),臨床癥狀以孕畜流產(chǎn)、死胎及新生胎兒運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前尚缺乏有效的藥物或者疫苗進(jìn)行防控,原因之一主要是對(duì)新孢子蟲的致病機(jī)制及宿主的免疫應(yīng)答了解不清楚。寄生蟲病的發(fā)生是病原體和宿主共同作用的結(jié)果,受到病原微生物刺激后,宿主細(xì)胞通過病原模式識(shí)別受體(PRRs)來識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs),從而啟動(dòng)抗寄生蟲的天然免疫應(yīng)答,以防止病原寄生蟲的進(jìn)一步感染,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,但具體的激活機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞外囊泡(EVs)作為細(xì)胞向外界分泌的具有生物活性的小分子,由于其攜帶了豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì),被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì),能在細(xì)胞與細(xì)胞間或者細(xì)胞與周圍環(huán)境間傳遞信號(hào)。大量研究表明,許多原生性寄生蟲都能分泌EVs,并通過EVs進(jìn)行信息傳遞,包括在蟲體之間傳遞毒力因子、藥物抗性基因等等,或者參與宿主的免疫應(yīng)答過程,對(duì)寄生蟲的發(fā)育、疾病的發(fā)展、甚至宿主應(yīng)答均產(chǎn)生重要的影響。但是,新孢子蟲是否會(huì)產(chǎn)生EVs,以及在宿主的天然免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮怎樣的作用目前還未見報(bào)道。因此進(jìn)行本研究,對(duì)新孢子蟲EVs的研究將有助于我們進(jìn)一步了解新孢子蟲病的致病機(jī)制,為預(yù)防和治療新孢子蟲病提供新的診斷方法和治療思路。新孢子蟲胞外囊泡的分離鑒定和蛋白組學(xué):通過差速超速離心方法收集新孢子蟲胞外囊泡(NEVs),透射電鏡和掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,收集的NEVs呈典型的“球狀”或“杯托”狀,具有明顯雙層膜結(jié)構(gòu),新孢子蟲蟲體周圍可見大小均勻的囊泡樣物質(zhì);納米顆粒追蹤顯示NEVs大小均勻且平均粒徑大小為124±20.89nm,濃度為5.1±1.32×109個(gè)/m L;鳥槍法(Shotgun)對(duì)NEVs進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,共鑒定出705種蛋白質(zhì),包括Actin、14-3-3、HSP70/90、Enolase和Rab等外泌體標(biāo)志性蛋白,KEGG分析蛋白參與的信號(hào)通路,705種蛋白共參與了97條信號(hào)通路,包括PI3K-Akt、MAPK、NOD樣和Toll樣信號(hào)通路等,表明NEVs參與了宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答的調(diào)控。新孢子蟲胞外囊泡介導(dǎo)的TLRs宿主天然免疫應(yīng)答機(jī)制:首先,本研究通過激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了NEVs與小鼠骨髓巨噬細(xì)胞(BMDMs)的相互關(guān)系,PKH67標(biāo)記NEVs后再刺激BMDMs,結(jié)果顯示2 h后,在宿主細(xì)胞中能檢測(cè)到熒光信號(hào),且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),熒光信號(hào)也不斷增強(qiáng),表明NEVs進(jìn)入BMDMs呈時(shí)間依賴性,并且松弛素處理能顯著抑制NEVs的攝入,表明NEVs進(jìn)入小鼠BMDMs依賴于細(xì)胞的主動(dòng)吞噬功能;之后,NEVs刺激小鼠BMDMs后,檢測(cè)TLRs的激活情況,熒光定量結(jié)果顯示,NEVs能顯著激活TLR2、TLR3和TLR4;ELISA結(jié)果表明,NEVs刺激野生型(WT)小鼠BMDMs后炎性細(xì)胞因子IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、IL-1β顯著升高,TLR2缺陷型(TLR2-/-)小鼠BMDMs炎性細(xì)胞因子IL-12p40、TNF-α和IFN-γ明顯低于WT組;Western blot結(jié)果顯示W(wǎng)T組P38、ERK和JNK磷酸化水平明顯高于TLR2-/-組,且P38、ERK和JNK抑制劑處理細(xì)胞后炎性因子IL-12p40、IL-6和IL-10的分泌量增高,表明NEVs能激活TLR2依賴的MAPK信號(hào)通路從而調(diào)控小鼠BMDMs的免疫應(yīng)答過程。新孢子蟲胞外囊泡蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)和免疫調(diào)控分子Nc14-3-3的表達(dá)和功能研究:通過分析篩選出NEVs中的三種蛋白Nc14-3-3、Nc HSP70、Nc Enolase進(jìn)行表達(dá)和特性研究,Western blot結(jié)果顯示這三種蛋白都存在于NEVs中;用制備的抗體進(jìn)一步檢測(cè)NEVs進(jìn)入宿主細(xì)胞的情況,免疫熒光結(jié)果顯示,作用3 h后在小鼠BMDMs中能檢測(cè)到蛋白的進(jìn)入,且隨著時(shí)間延長(zhǎng),蛋白量也在不斷增加,表明NEVs能將攜帶的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞內(nèi)。隨后進(jìn)一步對(duì)Nc14-3-3進(jìn)行了功能研究,成功表達(dá)純化獲得新孢子蟲14-3-3蛋白(Nc14-3-3),免疫熒光和免疫電鏡結(jié)果顯示14-3-3蛋白主要位于蟲體胞漿,少量位于細(xì)胞膜;Western blot和ELISA結(jié)果顯示,Nc14-3-3能激活MAPK和AKT信號(hào)通路,促進(jìn)炎性因子IL-12p40、IL-6和TNF-α的分泌,MAPK和AKT通路抑制劑處理后,炎性因子IL-12p40、IL-6和TNF-α的表達(dá)量明顯降低,TLR2-/-組觀察到了相同的結(jié)果,表明Nc14-3-3能激活MAPK和AKT信號(hào)通路調(diào)控宿主的炎性應(yīng)答,此外Nc14-3-3還能激活NF-κB/p65信號(hào)通路,促進(jìn)p65的入核;動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示NEVs和Nc14-3-3免疫后再感染新孢子蟲,能顯著降低小鼠的死亡率、減少組織蟲荷量、緩解組織病理變化,表明NEVs和Nc14-3-3可以作為抗新孢子蟲的候選疫苗靶標(biāo)。綜上所述,本研究表明新孢子蟲能分泌外泌體樣胞外囊泡,NEVs能激活小鼠骨髓源巨嗜細(xì)胞天然模式識(shí)別受體TLR2/3/4,并通過TLR2依賴的MAPK信號(hào)通路調(diào)控下游炎性細(xì)胞因子IL-12p40和IFN-γ的表達(dá)和分泌;免疫調(diào)控分子Nc14-3-3能通過激活宿主MAPK、AKT和NF-κB/p65信號(hào)通路來調(diào)控小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-12p40、IL-6和TNF-α的表達(dá)和分泌;并且NEVs和r Nc14-3-3免疫小鼠后能降低小鼠死亡率、延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間、減輕組織病理變化。以上研究揭示了新孢子蟲與宿主互作的一種新機(jī)制,且NEVs和r Nc14-3-3可以作為抗新孢子蟲病的候選疫苗。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.723

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本文編號(hào)：2653894