【摘要】：蜱為一類專性吸血的體外寄生動(dòng)物,寄生于哺乳類、鳥(niǎo)類、爬行類和兩棲類,傳播真菌、細(xì)菌、立克次氏體、病毒、螺旋體和等病原體,引起寄主多種疾病,如細(xì)菌性疾病、森林腦炎、Q熱、出血熱、蜱媒斑點(diǎn)熱和萊姆病等。卵黃蛋白是一種血紅素結(jié)合糖脂蛋白。在胚胎發(fā)育中作為營(yíng)養(yǎng)源,通過(guò)程序性降解,提供卵發(fā)育所需的氨基酸、糖和脂類等,這一過(guò)程需要多種酶參與。有關(guān)酶與卵黃蛋白和胚胎發(fā)育的研究主要集中在昆蟲(chóng),蜱類中僅在微小扇頭蜱有報(bào)道。組織蛋白酶D屬于天冬氨酸蛋白酶,是一種重要的酸性水解酶。組織蛋白酶D與卵黃蛋白間的關(guān)系在長(zhǎng)角血蜱中尚未研究。本論文以長(zhǎng)角血蜱為對(duì)象,運(yùn)用DNA測(cè)序、qPCR技術(shù)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)等方法,對(duì)其胚胎發(fā)育過(guò)程中組織蛋白酶D的變化及其在卵黃蛋白降解中的作用進(jìn)行了研究。組織蛋白酶D表達(dá)量結(jié)果顯示,胚胎發(fā)育1~9天表達(dá)量弱,第11天顯著增加且達(dá)到峰值,11天后逐漸下降。酶活性結(jié)果顯示,組織蛋白酶D在胚胎發(fā)育整個(gè)階段均有活性,1~5天呈下降趨勢(shì),7~13天急劇上升,13天最高,13~17天逐漸下降。干擾飽血和饑餓雌蜱中組織蛋白酶D基因,飽血雌蜱產(chǎn)卵量(0.13 g)與對(duì)照組無(wú)明顯差異,卵的孵化率(57.22%)與對(duì)照組(88.53%)差異顯著,表明在飽血期干擾組織蛋白酶D基因可影響卵的孵化。饑餓雌蜱產(chǎn)卵量(0.09 g)與對(duì)照組無(wú)顯著差異,孵化率(65.38%)與對(duì)照組(84.97%)有明顯差異,說(shuō)明在饑餓期干擾組織蛋白酶D基因影響卵的孵化。提取13天卵粗提物與不同濃度組織蛋白酶D和組織蛋白酶D抑制劑PepstainA孵育,結(jié)果表明組織蛋白酶D對(duì)卵黃蛋白降解有作用且呈現(xiàn)劑量關(guān)系。1 U的組織蛋白酶D對(duì)卵黃蛋白降解無(wú)影響,3 U對(duì)卵黃蛋白降解有影響,6 U時(shí)卵黃蛋白幾乎全部被降解。與組織蛋白酶D抑制劑孵育后,卵黃蛋白降解受到抑制,說(shuō)明組織蛋白酶D參與卵黃蛋白降解。上述研究結(jié)果為深入闡明蜱類胚胎發(fā)育中酶的調(diào)控提供依據(jù)。
【圖文】：

94℃ 60 s55℃ 30 s94℃ 30 s溶解曲線需要驗(yàn)證 PCR 產(chǎn)物的特異性。樣品進(jìn)行 6 次生分析與處理量 PCR 的處理結(jié)果采用 2ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算實(shí)均 Ct 值；由實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 Ct 值減去對(duì)應(yīng)內(nèi)參基因 β驗(yàn)組 ΔCt 值減去對(duì)照組 ΔCt 值得到 ΔΔCt 值。驗(yàn)結(jié)果蛋白酶 D 基因片段的擴(kuò)增er Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)長(zhǎng)角血蜱組織蛋白酶 D 的特異性引到一個(gè)與預(yù)期片段大小一致的 165 bp 的擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增

圖 2-2 組織蛋白酶 D 定量基因的菌落 PCR 擴(kuò)增電泳圖M：DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-10：特異性擴(kuò)增片段Fig. 2-2. Colony PCR amplification electropherogram of cathepsin D quantitative geneM: DNA Marker; 1-10: Fragment of cathepsin D by specific amplification2.3.3 組織蛋白酶 D 定量基因測(cè)序結(jié)果比對(duì)用 DNAMAN 軟件將測(cè)序結(jié)果與已上傳的組織蛋白酶 D 的基因序列進(jìn)行比對(duì)，兩者堿基的相似度為 99.38 ％，蛋白序列并無(wú)差異，表明設(shè)計(jì)的組織蛋白酶 D 定量引物正確，，堿基序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖 2-3：
【學(xué)位授予單位】：河北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.746

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本文編號(hào)：2653409