發(fā)布時(shí)間：2020-05-07 03:43

【摘要】：由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的口蹄疫(foot-and-mouth,FMD)是發(fā)生于羊、牛、豬等偶蹄動(dòng)物中的烈性、急性和高度傳染性疾病。此病給全球畜牧業(yè)造成非常大的損失。天然免疫反應(yīng)是機(jī)體抵御病毒感染的第一道防線,起到清除病原體,保護(hù)機(jī)體的作用。FMDV感染宿主會(huì)引起宿主的天然免疫反應(yīng),同時(shí)FMDV也會(huì)利用宿主自身的蛋白拮抗宿主免疫反應(yīng)而促進(jìn)自身的復(fù)制。DEAD-box RNA解旋酶(DDX56)主要參與RNA的代謝過程,研究表明其可以促進(jìn)西尼羅病毒(WNV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)的復(fù)制,但其中的機(jī)制并不清楚。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)人源DDX56可以減少仙臺(tái)病毒(Sendai virus,SeV)引起的IFN-β的生成,并且發(fā)現(xiàn)豬源DDX56可以促進(jìn)FMDV的復(fù)制,表明這兩者之間有一定的聯(lián)系。首先為了闡明人源DDX56阻止IFN-β生成的分子機(jī)制,過表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明人源DDX56可以明顯阻止IFN-β通路的激活和IFNB1基因的轉(zhuǎn)錄。而將人源DDX56沉默或缺失后,SeV引起的IFN-β的表達(dá)水平明顯升高,水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的復(fù)制水平明顯降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)病毒感染可以促使人源DDX56與IRF3互作。過表達(dá)人源DDX56可以明顯減少IRF3的入核。而人源DDX56沉默和敲除后,病毒引起的IRF3的入核增加。另外我們也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)人源DDX56可以阻止IRF3和IPO5的相互作用,而沉默或缺失人源DDX56后,IRF3與IPO5的相互作用明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果表明人源DDX56通過破壞IRF3與IPO5的相互作用來減少IRF3的入核。為了確定人源DDX56的功能位點(diǎn),我們構(gòu)建了人源DDX56的突變體,發(fā)現(xiàn)人源DDX56的D166位點(diǎn)是其發(fā)揮抑制天然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵功能位點(diǎn)。為了探究豬源DDX56在FMDV復(fù)制中的作用,我們檢測(cè)了豬源DDX56對(duì)FMDV復(fù)制的影響。結(jié)果表明過表達(dá)豬源DDX56可以明顯促進(jìn)FMDV的復(fù)制,而沉默豬源DDX56則使FMDV的復(fù)制減少。我們發(fā)現(xiàn)豬源DDX56可以阻止病毒引起的IFN-β的活化,并且與IRF3有相互作用。為了進(jìn)一步探究豬源DDX56促進(jìn)FMDV復(fù)制的分子機(jī)制,我們通過報(bào)告基因篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬源DDX56可以協(xié)同F(xiàn)MDV病毒蛋白VP0,VP1,VP2和3A阻止IFN-β的活化。并且通過免疫共沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬源DDX56可以與FMDV病毒蛋白VP0,VP1,VP2和3A有相互作用。進(jìn)一步試驗(yàn)證明,豬源DDX56可以協(xié)同F(xiàn)MDV 3A減少磷酸化IRF3的水平,同時(shí)豬源DDX56的D166位點(diǎn)是其促進(jìn)FMDV復(fù)制的關(guān)鍵位點(diǎn)�？傊�,我們發(fā)現(xiàn)人源DDX56在病毒感染細(xì)胞后能與IRF3相互作用,破壞了IRF3與IPO5復(fù)合體的形成而抑制IRF3的入核,從而負(fù)調(diào)控病毒引起的IFN-β的生成。在隨后的研究中,我們發(fā)現(xiàn)在FMDV感染期間,豬源DDX56可以協(xié)同F(xiàn)MDV 3A減少IRF3的磷酸化而減少IFN-β的生成,最終促進(jìn)FMDV的復(fù)制。我們的研究闡述了病毒誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的部分調(diào)控機(jī)制,同時(shí)闡述了FMDV拮抗宿主天然免疫系統(tǒng)的新機(jī)制,深化了我們對(duì)宿主天然免疫和FMDV致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
【圖文】：

14圖 2.2 沉默 DDX56 顯著促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的 IFN-β 的活化（A）DDX56-RNAi 質(zhì)粒對(duì)內(nèi)源性 DDX56 表達(dá)的影響。（B-E）沉默 DDX56 促進(jìn) Poly I:C 或 SeV 誘導(dǎo)的 ISRE 和啟動(dòng)子 IFN-β 的激活。將構(gòu)建的 DDX56-knockdown 的 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 100 ng IFN-β 或 100 ng ISRE 報(bào)告基因質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染 20 h 后，細(xì)胞用 SeV 刺激 12 h，或者 Poly I:C (1 μg/ml)刺激 18 h 或不處理，然后進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)。（F）沉默 DDX56 增加 SeV 誘導(dǎo)的 TBK1, IRF3 和 IκBα 的磷酸化。將 DDX56-knockdown 的 293T 細(xì)胞用 SeV 刺激 0 h，6 h，12 h 或不處理，收取細(xì)胞樣品用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。（G-K）沉默 DDX56 促進(jìn) SeV 誘導(dǎo)的 IFNB1,TNFa, Il8, Rantens 和 Isg56 基因的轉(zhuǎn)錄。將 DDX56-knockdown 的 293T 細(xì)胞用 SeV 刺激 12 h 或不處理，然后進(jìn)行 Q-PCR 檢測(cè)。Fig. 2.2 Knockdown of DDX56 potentiates virus-triggered induction of IFN-β(A) Effects of DDX56-RNAi plasmids on the expression of endogenous DDX56. (B-E) Knockdown of DDX56potentiates SeV- or Poly I:C-triggered activation of the IFN-β promoter and ISRE. The stable DDX56-knockdown 293Tcells were transfected with the IFN-β promoter or ISRE (100 ng). Twenty-four hours after transfection, the cells were leftuninfected or infected with SeV for 12 h or were treated or untreated with Poly I:C (1 μg/ml) for 18 h before reporterassays were performed. (F) Knockdown of DDX56 increases the SeV-induced phosphorylation of TBK1, IRF3 and IκBα.

圖 2.4 DDX56 在 IRF3 水平調(diào)控 IFN-β 的產(chǎn)生（A-B）DDX56 通過不同的信號(hào)原件對(duì) IFN-β 啟動(dòng)子和 ISRE 激活中的作用。將 293T 轉(zhuǎn)染 ISRE 和啟動(dòng)子 IFN-β報(bào)告質(zhì)粒各 100 ng，同時(shí)轉(zhuǎn)染 DDX56 表達(dá)質(zhì)粒和 RIG-I (CARD)、MDA5、VISA、TBK1 和 IRF3 表達(dá)質(zhì)粒各 100ng，轉(zhuǎn)染 24 h 后進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)。Fig. 2.4 DDX56 mediates virus-triggered signaling at the level of IRF3.(A-B) DDX56 affects the activation of IFN-β promoter and ISRE by various signal components. The 293T cells weretransfected with the IFN-β promoter or ISRE reporter (100 ng), and the expression plasmids for DDX56 and the indicatedproteins (100 ng each). Luciferase assays were performed 24 h after transfection.2.4.5 DDX56 與 IRF3 存在相互作用以上實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明 DDX56 在 IRF3 水平抑制 IFN-β 的產(chǎn)生，，我們接下來驗(yàn)證 DDX56 與 IRF3之間是否發(fā)生相互作用。因?yàn)?IRF3 與 IRF7 能形成異源二聚體，且 IRF3 與 IRF7 有較高的同源性，因此我們將 DDX56 分別與 IRF3 或 IRF7 共轉(zhuǎn)染，然后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明 DDX56與 IRF3 相互作用而與 IRF7 沒有相互作用（圖 2.5A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 DDX56 與 IRF3 的相互作用，我們進(jìn)行內(nèi)源性 CO-IP 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) DDX56 與內(nèi)源性 IRF3 能發(fā)生互作，并且兩者之間的相互作用不依賴于 SeV 的感染（圖 2.5 B）。我們又通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DDX56 與 IRF3 存在共定
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2652379