發(fā)布時間：2020-05-07 03:33

【摘要】：作為家禽最主要的經(jīng)濟性狀之一,產(chǎn)蛋性狀(包括產(chǎn)蛋枚數(shù)和蛋重等)在不同品種或品系之間存在著顯著差異,此差異主要源于雞的卵泡發(fā)育,而其中前等級卵泡的發(fā)育影響著優(yōu)勢卵泡選擇及產(chǎn)蛋性能,因此,本研究以雞前等級卵泡為供試材料,深入挖掘影響前等級卵泡發(fā)育的因素。有研究表明,婆羅雙樹基因Spalt(Sall)能夠在人類和小鼠的胚胎和生殖器官的發(fā)育過程中起到非常重要的調(diào)控作用,但其在雞卵泡生長發(fā)育過程的調(diào)節(jié)作用卻未有報道。本研究以海蘭褐蛋雞為實驗材料,在對雞SALL1(csal1)和SALL3(csal3)基因的m RNA和蛋白質(zhì)在前等級卵泡中的時空表達模式進行分析的基礎(chǔ)上,利用PCR-SSCP技術(shù)檢測csal1和csal3基因在大骨雞產(chǎn)蛋性狀上的遺傳效應(yīng),并采用過表達、干擾等實驗方法,利用熒光定量PCR(RT-q PCR)技術(shù)檢測分析csal1和csal3基因m RNA的過表達以及小RNA干擾(si RNA)對顆粒細胞中CCND1、Bcat、St AR、CYP11A1和FSHR基因m RNA表達水平的影響;且利用Brd U試劑盒檢測顆粒細胞的增殖變化,從而探討csal1和csal3基因?qū)η暗燃壜雅蓊w粒細胞的增殖、分化和卵泡選擇的潛在作用及調(diào)控機制。主要研究結(jié)果如下:1.csal1和csal3基因m RNA在前等級卵泡中的表達模式定性PCR實驗結(jié)果顯示,csal1和csal3基因m RNA在雞卵巢不同發(fā)育階段的前等級卵泡(直徑1-3.9 mm、4-4.9 mm、5-5.9 mm、6-6.9 mm、7-8 mm)中均有表達,提示csal1和csal3基因參與前等級卵泡的生長發(fā)育。利用熒光定量PCR檢測csal1和csal3基因m RNA在不同發(fā)育階段的前等級卵泡中的表達量,結(jié)果顯示隨著前等級卵泡顆粒細胞的增殖與分化,csal1基因呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢,到直徑6-6.9 mm的卵泡中的表達量最高;隨著前等級卵泡的發(fā)育,csal3基因表達亦呈現(xiàn)上升的趨勢,到直徑7-8 mm的卵泡中的表達量最高,初步揭示兩個基因在m RNA水平參與前等級卵泡的發(fā)育調(diào)控。2.CSAL1和CSAL3蛋白質(zhì)分子在前等級卵泡中的時空表達模式免疫熒光結(jié)果顯示,CSAL1和CSAL3蛋白在不同發(fā)育階段的前等級卵泡中的顆粒細胞、卵母細胞、間質(zhì)以及上皮細胞中均表達;且主要分布在細胞質(zhì)中,推測CSAL1和CSAL3可能均以核移位的方式參與不同大小前等級卵泡發(fā)育的調(diào)控作用。3.csal1和csal3基因在大骨雞產(chǎn)蛋性狀上的遺傳效應(yīng)通過PCR-SSCP技術(shù)篩選候選基因csal1和csal3的SNP位點,并依據(jù)收集的產(chǎn)蛋相關(guān)數(shù)據(jù)來探討csal1和csal3基因多態(tài)性與大骨雞產(chǎn)蛋性狀(蛋重、產(chǎn)蛋量等)的相關(guān)性。PCR-SSCP實驗并關(guān)聯(lián)產(chǎn)蛋性狀的分析結(jié)果顯示:csal1基因第2外顯的SNP位點(729 CA)和csal3基因第2外顯的SNP位點(1014 TA),與產(chǎn)蛋性狀(蛋重、產(chǎn)蛋量)有相關(guān)性,且對應(yīng)的加性效應(yīng)百分比相對較高。在四個組合基因型中,TATT基因型與產(chǎn)蛋性狀(蛋重、產(chǎn)蛋量)具有較高的相關(guān)性。結(jié)果表明,在參與卵泡發(fā)育的csal1和csal3基因中篩選出的兩個與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點,可作為潛在的分子標記為選育高產(chǎn)蛋雞提供分子生物學理論基礎(chǔ)。4.csal1和csal3基因過表達對前等級卵泡生長發(fā)育的抑制作用在成功轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒(陰性對照)與重組的表達載體p Yr-adshuttle-4-csal1和p Yr-adshuttle-4-csal3的顆粒細胞中,CCND1、Bcat、St AR、CYP11A1和FSHR基因m RNA的表達水平均顯著下降(P0.05),且顆粒細胞的增殖顯著降低(P0.05),說明csal1和csal3基因m RNA過表達對前等級卵泡顆粒細胞的增殖、分化以及卵泡的選擇具有抑制的作用,此過程中,過表達csal1基因后,csal3基因m RNA的表達水平顯著上調(diào)(P0.05),同樣,過表達csal3基因后,csal1基因m RNA的表達水平顯著上調(diào)(P0.05),同時過表達兩基因后,上述五個基因的表達水平及顆粒細胞增殖水平明顯低于其他各組,據(jù)此推測,csal1和csal3基因?qū)η暗燃壜雅萆L發(fā)育具有協(xié)同調(diào)控的作用。5.進一步驗證csal1和csal3基因協(xié)同抑制前等級卵泡生長發(fā)育的作用采用si RNA干擾的方法進一步驗證在前等級卵泡中csal1和csal3基因?qū)ζ渖L發(fā)育的抑制作用,結(jié)果顯示,前等級卵泡顆粒細胞的增殖以及細胞中CCND1、Bcat、St AR、CYP11A1和FSHR基因m RNA的表達水平均顯著上調(diào)(P0.05),證實csal1和csal3基因?qū)η暗燃壜雅蓊w粒細胞的增殖、分化和卵泡選擇具有抑制作用;此過程中,干擾csal1基因后顯著抑制csal3基因m RNA的表達水平(P0.05),同樣,干擾csal3基因后顯著抑制csal1基因m RNA的表達水平(P0.05),同時干擾兩基因后,上述五個基因的表達水平及顆粒細胞增殖水平明顯高于其他各組,此結(jié)果進一步驗證了csal1和csal3基因?qū)η暗燃壜雅莸纳L發(fā)育發(fā)揮著協(xié)同調(diào)控的作用。本研究顯示,csal1和csal3基因m RNA在前等級卵泡的不同發(fā)育階段均有表達,且其蛋白質(zhì)分子的表達定位在顆粒細胞、卵母細胞、卵巢間質(zhì)和上皮細胞中;在csal1和csal3基因中篩選出的兩個與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點,可作為潛在的分子標記為選育高產(chǎn)蛋雞提供分子生物學理論基礎(chǔ);過表達和干擾結(jié)果表明,csal1和csal3基因?qū)η暗燃壜雅萆L發(fā)育的調(diào)控是通過協(xié)同抑制顆粒細胞的增殖、分化和卵泡的選擇來實現(xiàn)的,此為進一步揭示csal1和csal3基因調(diào)控前等級卵泡的作用機制提供了分子依據(jù),在募集卵泡、選擇優(yōu)勢卵泡和卵泡等級化發(fā)育的方面提供了深入研究其遺傳機理的理論基礎(chǔ);也為提高雞產(chǎn)蛋性狀的主效基因的挖掘以及進一步開展以提升產(chǎn)蛋性狀為育種目標的地方品種改良提供了參考依據(jù),具有重要的科學意義和學術(shù)價值。
【圖文】：

存在于卵泡（follicle）中，但在成年階段，，僅有數(shù)百個卵母細胞會被選擇，最終發(fā)育成熟并成功排卵，其中不同等級卵泡數(shù)量的動態(tài)平衡是通過募集卵泡、優(yōu)勢卵泡的選擇等來維持的，這是一個及其復(fù)雜的過程[4,8-11]。這數(shù)百個可發(fā)育成熟的卵母細胞中，包含了成百的小白卵泡（SWF）和大白卵泡（LWF），小黃卵泡（SYF）以及大黃卵泡（LYF）。小白卵泡（直徑≤1 mm），大白卵泡（直徑 2-5 mm）和小黃卵泡（直徑 5-8 mm）被統(tǒng)稱為前等級卵泡，而大黃卵泡（直徑 9-40 mm）即為排卵前的等級卵泡，只有極少數(shù)的前等級卵泡可以進入等級卵泡，它們遵循著一個嚴格的等級化程序（F1-F6），F(xiàn)1 代表了已經(jīng)成熟，即將排卵的卵泡，F(xiàn)6則代表等級卵泡中最后成熟排卵的卵泡。這樣一個等級化制度保證了每天都會有一個卵泡從小黃卵泡池中被選擇進入等級化卵泡池中發(fā)育成排卵卵泡[10,12,13]。同樣，大白卵泡的募集也是一個持續(xù)的過程來保證小黃卵泡池。排卵后不形成黃體，這是禽類與哺乳動物的不同所在，是禽類卵泡發(fā)育的獨特之處[14]。隨著發(fā)育的成熟，卵巢的重量也隨之增大，在卵巢表面突出著外觀如一串葡萄的卵泡，它們是由不同顏色、不同大小的卵泡依靠卵泡柄相連。成熟卵泡內(nèi)只有其中分布毛細血管的卵泡膜，而沒有卵泡液及卵泡腔[4,15]。

csal1基因的定性PCR檢測Fig.1.1QualitativePCRdetectionofcsal1gene
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S831.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 曹雪嬌;劉巍;譚文華;;Wnt通路在卵巢中的生理作用及腫瘤學研究進展[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2014年10期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 秦寧;SLIT2和SLIT3分子在雞前等級卵泡生長發(fā)育中的調(diào)控作用[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2016年

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 鄧熙;miR-126-3p調(diào)控豬卵巢顆粒細胞功能的研究[D];華南農(nóng)業(yè)大學;2016年

本文編號：2652368