【摘要】：毒害艾美耳球蟲(Eimeria necatrix)是7種雞球蟲中致病性最大的蟲種之一,主要危害8～18周齡的雞,引起急性小腸球蟲病,給養(yǎng)雞業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失,因此迫切需要尋找可行的防控措施。雞球蟲的生活史包括孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖三個階段,其生長發(fā)育過程中的一些關(guān)鍵性調(diào)控因子可能是防控雞球蟲病的有效作用靶點。在本課題組的前期研究工作中,已應(yīng)用SMART技術(shù)構(gòu)建了毒害艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫。在此基礎(chǔ)上,本研究對該文庫進一步篩選,以獲取毒害艾美耳球蟲的功能基因,并對毒害艾美耳球蟲SNF2基因進行克隆表達和免疫原性分析,為研究毒害艾美耳球蟲亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。首先,用免疫學和質(zhì)粒文庫兩種方法對毒害艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫進行篩選,獲取EST序列。(1)免疫學方法:用制備的鼠抗子孢子可溶性蛋白多抗作為一抗,對文庫進行篩選,初篩得到40個疑似陽性克隆,經(jīng)兩次復(fù)篩后獲得190個陽性克隆;將復(fù)篩得到的陽性噬菌體載體λTriplEx2轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒載體pTriplEx2后,送公司測序,得到26條球蟲基因組的EST序列,共5個重疊群。(2)質(zhì)粒文庫方法:直接將λTriplEx2噬菌體文庫轉(zhuǎn)化為pTripIEx2文庫,選出150個克隆,送公司測序,得到53條EST序列,共21個重疊群。比較兩種方法獲得的EST序列,有5條序列相同。對21個重疊群的生物信息學分析顯示,其分別編碼參與DNA復(fù)制過程的SNF2家族解旋酶、延伸因子G,參與RNA前體剪接過程的剪切因子,調(diào)節(jié)蛋白如絲氨酸蛋白酶抑制劑,參與細胞周期調(diào)控的PUA結(jié)構(gòu)域蛋白,線粒體內(nèi)膜tim17亞單位,結(jié)構(gòu)域蛋白如絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶、腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白,子孢子入侵相關(guān)的微線體蛋白mic-1、核糖體蛋白、頂體膜抗原、MA2(ma-2)mRNA,Etm033F10 假設(shè)蛋白,Etm087F12 假設(shè)蛋白,Etm032G09 假設(shè)蛋白和Etm128F02假設(shè)蛋白。其次,從獲得的EST序列中選取毒害艾美耳球蟲SNF2基因開展研究。根據(jù)GenBank中毒害艾美耳球蟲SNF2基因序列設(shè)計3對引物,用RT-PCR的方法,通過分段擴增再拼接的方法獲得了毒害艾美耳球蟲全長SNF2基因序列,并對該基因進行了氨基酸序列、功能結(jié)構(gòu)域等分析研究。該基因全長3 426 bp。接著對SNF2基因N端結(jié)構(gòu)域序列進行截短原核表達,表達的融合蛋白大小為36 kDa左右,主要以包涵體形式存在。用表達產(chǎn)物制備鼠多抗,再以該多抗經(jīng)Western blot檢測子孢子可溶性蛋白,發(fā)現(xiàn)天然的SNF2蛋白大小為120 kDa左右,與預(yù)測的理論值相符。最后,將純化復(fù)性的重組蛋白rEnSNF2按不同劑量(200、100、50 μg/羽)免疫無球蟲感染的雛雞,免疫2次后,除未免疫未攻蟲組外,其余各試驗組均感染毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊,以成活率、卵囊減少率、病變記分、平均增重等為指標,評測重組蛋白的免疫保護效果。結(jié)果顯示,rEnSNF2以每羽雞200μg的免疫劑量保護效果最好,與未免疫未攻蟲組相比,重組蛋白rEnSNF2能降低病變記分與卵囊產(chǎn)量,提高存活率,并能誘導機體產(chǎn)生特異性抗體。
【圖文】：

性斑的邊緣形成明顯的深紫色環(huán)，而中央部分顏色相對較淡，大部分陽性斑的斑緣外周有逡逑較淡的白色暈環(huán)。陰性斑主要特征為白色暈環(huán)，個別白色反應(yīng)斑中央雖有雜交痕跡但顯色逡逑較淡（圖１－１）。逡逑Ｌ邋ｊ逡逑圖１－１毒害艾美耳球蟲子抱子ｃＤＮＡ文庠免疫學篩選結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．１－１邋Ｉｍｍｕｎｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｎｅｃａｔｒｉｘ邋ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ邋ｃＤＮＡ邋ｌｉｂｒａｒｙ逡逑２．２質(zhì)粒文庫方法篩選結(jié)果逡逑

逡逑挑取長勢較好的單菌落進行ＰＣＲ檢測（圖１－２），結(jié)果顯示，質(zhì)粒文庫片段大小集中逡逑在３００－１邋５００ｂｐ之間，與構(gòu)建文庫時的鑒定結(jié)果相吻合。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１邐２邐３邐４邐５邐６邐７邐８邐９邐１０邋１１邋１２邋１３邐１４邋１５邋１６邋１７邋１８邐１９邋２０邐２１逡逑ｆｃｇＷｌｒｉＢｌＩＭＭａｉＢｉｒ１—ＨｌＷｉｉＬ．．邋ｒｙ＾ｒ２逡逑ＵＭｉｉｉｉＢＭＭｉＭｌＩＢＢＩＢＢｌＩＢＢＢＢＢＢＢｌｉＢｉｉ逡逑圖１－２陽性克�。校茫耶a(chǎn)物的凝肢電泳結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．１－２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃＤＮＡ邋Ｌｉｂｒａｒｙ邋ｃｌｏｎｅｓ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ標準分子量ＤＬ２邋０００；邋１－２１：陽性克�。校茫耶a(chǎn)物逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ邋２邋０００；邋１－２１：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｌｏｎｅｓ逡逑２．３獲得的ＥＳＴ序列與功能分析逡逑比較免疫學篩選和質(zhì)粒文庫篩選兩種方法獲得的ＥＳＴ，有５條序列相同的。對２１個逡逑重疊群的生物信息學分析顯示，，分別編碼參與ＤＮＡ復(fù)制過程的ＳＮＦ２家族解旋酶，調(diào)節(jié)逡逑蛋白如絲氨酸蛋白酶抑制劑，參與細胞周期調(diào)控的ＰＵＡ結(jié)構(gòu)域蛋白，線粒體內(nèi)膜ｔｉｍｌ７逡逑亞單位，結(jié)構(gòu)域蛋白如絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酶，子孢子入侵相關(guān)的微線體蛋白、核糖逡逑體蛋白、Ｍｉｃ－１、ＭＡ２邋（ｍａ－２）邋ｍＲＮＡ邋等（表邋１－３）。逡逑表１－３邋ｃＤＮＡ文庫測序序列匯總逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－３邋ｔｈｅ邋ｓｕ
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.7

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本文編號：2652313