【摘要】：動物骨骼肌的發(fā)育是一個受到多種轉(zhuǎn)錄因子和多條信號通路調(diào)控的復(fù)雜過程,以往關(guān)于骨骼肌發(fā)育的調(diào)控研究主要集中在mRNA、miRNA和lncRNA方面。近年來的研究表明circRNA在肌肉的發(fā)育過程中呈動態(tài)表達(dá),并參與骨骼肌發(fā)育的調(diào)控,但目前關(guān)于山羊骨骼肌發(fā)育過程中circRNA的表達(dá)模式及機(jī)制研究還未見報道�；诖�,本研究以簡州大耳羊發(fā)育不同階段即妊娠期45d(E45)、60d(E60)、105d(E105)及出生后3d(B3)、60d(B60)、150d(B150),共12只母羔的背最長肌組織為研究材料,利用去線性RNA的方法富集circRNA后進(jìn)行RNA測序,鑒定山羊骨骼肌發(fā)育過程中表達(dá)的circRNA并對circRNA的基因組特征、表達(dá)模式及功能進(jìn)行分析。此外,本研究還以山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SMSCs)為實(shí)驗材料,研究了circPAPD7以及circQKI對SMSCs增殖和分化的影響,并對其作用機(jī)制進(jìn)行了解析,主要研究結(jié)果如下。1.12個測序文庫總共獲得964,968,566條讀長為150 nt的雙末端clean reads,總共產(chǎn)生約144.76 Gb的數(shù)據(jù)。其中有78.10%~85.56%的clean reads能比對到山羊基因組(GCF_001704415.1)上,有48.85%~55.95%的序列具有唯一的基因組位置。2.在山羊背最長肌的6個發(fā)育時期中共鑒定出14,655個circRNA,總共對應(yīng)4801個來源基因。circRNA在山羊染色體上均勻分布且無染色體偏好性,約90%的circRNA來源于外顯子區(qū)域,83.5%的circRNA轉(zhuǎn)錄本含有兩個及以上的外顯子,山羊circRNA的GC含量和外顯子數(shù)目均少于mRNA。山羊circRNA的側(cè)翼序列包含較長的內(nèi)含子。3.6276個circRNA在6個發(fā)育階段中共表達(dá);時序表達(dá)分析中circRNA顯著富集的表達(dá)模式共有14個,14個表達(dá)模式總共包括8136個circRNA;功能富集分析發(fā)現(xiàn),共表達(dá)的circRNA及STEM分析顯著的circRNA對應(yīng)的來源基因均能顯著富集到肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、MAPK信號通路、甲狀腺激素信號通路和Wnt信號通路等骨骼肌發(fā)育相關(guān)的信號通路中。共有1336個circRNA的表達(dá)量在不同發(fā)育階段兩兩之間存在顯著差異,層次聚類分析顯示差異表達(dá)的circRNA按不同發(fā)育階段聚集成了6組且嚴(yán)格按出生前和出生后聚成了兩大部分。4.在14,644個circRNA中總共預(yù)測到746,525個miRNA的結(jié)合位點(diǎn),circRNA與miRNA的結(jié)合呈現(xiàn)“多對多”的關(guān)系且miRNA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)在circRNA中呈現(xiàn)不均等分布。與circRNA結(jié)合的miRNA包含miR-1、miR-206和miR-133等肌肉特異性的miRNA,說明circRNA可作為miRNA的分子海綿參與肌肉發(fā)育的調(diào)控。5.利用RT-PCR和qPCR驗證了RNA-seq得到的circRNA的環(huán)化位點(diǎn)和表達(dá)趨勢,RT-PCR測序得到環(huán)化位點(diǎn)與RNA-seq得到的環(huán)化位點(diǎn)一致且兩種定量方法所得到的表達(dá)趨勢具有很高的相關(guān)性(r=0.93~0.99),表明RNA-seq測序結(jié)果可靠。6.circPAPD7含有miR-26a-5p的結(jié)合位點(diǎn),在SMSCs中過表達(dá)circPAPD7能極顯著上調(diào)增殖相關(guān)基因PCNA、Pax7以及miR-26a-5p靶基因EZH2的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖,同時過表達(dá)circPAPD7顯著下調(diào)成肌分化相關(guān)基因MyoD、MyoG、Myomaker、MyHC和miR-26a-5p的表達(dá)并抑制肌管形成;抑制circPAPD7的表達(dá)則導(dǎo)致增殖相關(guān)基因及EZH2的表達(dá)下調(diào)并抑制細(xì)胞增殖,同時成肌分化相關(guān)基因及miR-26a-5p的表達(dá)上調(diào)且肌管數(shù)增多。通過AgO2-RIP實(shí)驗進(jìn)一步驗證circPAPD7、miR-26a-5p及EZH2可通過ceRNA機(jī)制促進(jìn)山羊SMSCs的增殖并抑制分化。7.circQKI在背最長肌發(fā)育過程以及SMSCs增殖、分化過程中的表達(dá)變化與其來源基因QKI的表達(dá)趨于一致。過表達(dá)circQKI后增殖相關(guān)基因PCNA和Pax7、成肌分化相關(guān)基因MyoD、MyoG、Myomaker、MyHC和來源基因QKI的表達(dá)均極顯著上調(diào)并促進(jìn)細(xì)胞增殖以及肌管的形成;抑制細(xì)胞內(nèi)源性circQKI的表達(dá)后,上述增殖、分化基因及來源基因QKI的表達(dá)均下調(diào)同時新增細(xì)胞核及肌管數(shù)目減少。說明circQKI可通過上調(diào)QKI基因的表達(dá)促進(jìn)山羊SMSCs的增殖和分化。本研究通過對山羊骨骼肌組織circRNAs的篩選鑒定以及circPAPD7、circQKI參與調(diào)控山羊SMSCs的增殖分化機(jī)制的解析,為深入揭示山羊骨骼肌發(fā)育過程中的分子機(jī)制提供了參考依據(jù)。
【圖文】：

品種、性別、激素、營養(yǎng)水平、年齡、運(yùn)動量等因素的影響外還受到細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。1.1.2 骨骼肌生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控動物骨骼肌的生長發(fā)育是一個受到多種轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞信號通路調(diào)控的復(fù)雜生理過程(圖 1-1)。其中 Pax 基因家族(Paired-homeobox family)、生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors, MRFs)和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子 2(myocyte enhancer factor 2,MEF2) 相互作用調(diào)節(jié)下游肌生成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控肌肉的生長發(fā)育及肌肉再生。此外，Wnt 信號通路、BMP4 信號通路、p38 MAPK 信號通路等通過調(diào)控生肌調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，維持肌肉發(fā)育過程中增殖和分化的平衡。

lncRNA 不具有完整的開放閱讀框，不能編碼蛋白質(zhì)。此外，lncRNA 的保守性和表達(dá)豐度一般低于 mRNA，，但其時空特異性高于 mRNA[62]。lncRNA 可分別與 DNA、RNA 和蛋白質(zhì)結(jié)合，從表觀水平、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平等不同層面參與機(jī)體的生長發(fā)育和生理活動。如圖1-2所示，lncRNA的作用機(jī)制主要包括：(1) lncRNA 可結(jié)合在編碼基因的上游啟動子區(qū)域，干擾編碼基因的轉(zhuǎn)錄；(2) 通過染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾影響下游基因的表達(dá)；(3)與前體 mRNA 結(jié)合，影響編碼基因的可變剪接；(4) 產(chǎn)生內(nèi)源性小干擾 RNA，調(diào)控基因的表達(dá)；(5) 與特定的蛋白結(jié)合充當(dāng)核酸蛋白復(fù)合體的組成部分；(6) 結(jié)合到蛋白質(zhì)上改變其活性或者亞細(xì)胞定位；(7)作為 miRNA 等小 RNA 的前體，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 miRNA；(8) 作為 miRNA 的分子海綿，調(diào)節(jié) miRNA 靶基因的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S827

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本文編號：2651697