發(fā)布時(shí)間：2020-05-06 21:10

【摘要】：體外受精胚胎的體外培養(yǎng)是胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。胚胎質(zhì)量直接影響胚胎發(fā)育和胎兒生長。本研究首先觀察了小檗堿(Berberine,Ber)和miRNA-18b對(duì)豬體外受精胚胎發(fā)育率、囊胚細(xì)胞增殖及凋亡的影響;其次,探討B(tài)er和miRNA-18b對(duì)豬體外受精胚胎內(nèi)miRNA-18b、IGF-I、IGF-IR和HIF-1α在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控作用,以及檢測(cè)miRNA-18b的直接靶基因是否為IGF-I、IGF-IR和HIF-1α;最后探討了Ber和miRNA-18b對(duì)AKT通路的調(diào)控關(guān)系,為提高豬體外受精胚胎體外發(fā)育提供理論及數(shù)據(jù)支持。試驗(yàn)以未添加Ber的NCSU-23胚胎基礎(chǔ)培養(yǎng)液為對(duì)照組,Ber加入NCSU-23培養(yǎng)液中為Ber組,在對(duì)照組的原核胚細(xì)胞質(zhì)中顯微注射miRNA-18b過表達(dá)劑(agomir)、低表達(dá)劑(antagomir)和陰性片段分別為miRNA-18b agomir組、miRNA-18b antagomir組和NC組。觀察IVF胚胎2-、4-、8-細(xì)胞和桑椹胚、囊胚發(fā)育率;囊胚細(xì)胞差異染色法、Hoechst33342-TUNEL法分別觀察內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞總數(shù)和囊胚細(xì)胞凋亡數(shù);通過qRT-PCR、Western-blot和雙熒光素酶報(bào)告基因的方法驗(yàn)證miRNA-18b的靶基因IGF-I、IGF-IR和HIF-1α;Western-blot檢測(cè)AKT磷酸化水平。結(jié)果:Ber和miRNA-18b antagomir,可顯著提高豬IVF胚胎發(fā)育率、囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)層、總細(xì)胞數(shù)和和細(xì)胞總數(shù)以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)比率(P0.01或P0.05),極顯著降低囊胚細(xì)胞凋亡數(shù)(P0.01),提高了豬IVF胚胎的發(fā)育質(zhì)量。在4-、8-細(xì)胞和桑椹胚期,Ber極顯著地下調(diào)miRNA-18b的水平,而且miRNA-18b的水平隨著胚胎發(fā)育呈下降趨勢(shì),4-~8-細(xì)胞時(shí)期更為明顯;在4-、8-細(xì)胞和桑椹胚期,Ber和miRNA-18b antagomir能顯著上調(diào)豬IVF胚胎中IGF-I、IGF-IR和HIF-1α表達(dá)水平(P0.01或P0.05),miRNA-18b agomir顯著下調(diào)IGF-I、IGF-IR和HIF-1α表達(dá)水平(P0.01或P0.05);IGF-I、IGF-IR和HIF-1α的表達(dá)水平隨著胚胎發(fā)育呈上升趨勢(shì),4-~8-細(xì)胞階段更為明顯;雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明在IGF-I、IGF-IR和HIF-1α的3’UTR wt、mut重建載體轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的雙螢光素酶活性上,miRNA-18b與NC組均無顯著差異(P0.05)。Ber和miRNA-18b antagomir可極顯著提高AKT磷酸化水平(P0.01),miRNA-18b agomir能下調(diào)AKT磷酸化水平;AKT磷酸化水平隨著胚胎發(fā)育呈上升趨勢(shì),4-~8-細(xì)胞階段更為明顯。結(jié)論:Ber能夠通過下調(diào)4-、8-細(xì)胞和桑椹胚時(shí)期miRNA-18b的轉(zhuǎn)錄水平,促進(jìn)IGF-I、IGF-IR和HIF-1α的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)AKT的磷酸化,促進(jìn)豬IVF胚胎細(xì)胞的增殖和體外發(fā)育,其中4-~8-細(xì)胞時(shí)期作用更為明顯。然而,有關(guān)豬IVF胚胎中miRNA-18b的直接靶基因的問題還有待今后進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。
【圖文】：

章 microRNA 對(duì) IGF-I/ IGF-IR/HIF-1α 及 A的生理調(diào)控研究進(jìn)展NA（miRNA）是長度為 20~24 個(gè)核苷酸的非編碼 RNA，調(diào)控基因轉(zhuǎn) 最初被轉(zhuǎn)錄為具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí) miRNA，并在被核糖核酸酶 II（IR切割后，成為前體 miRNA（pre-miRNA），緊接著輸出蛋白 5 將 pre-m細(xì)胞質(zhì)中。RNaseIII 酶 Dicer 切割 pre-miRNA 以產(chǎn)生中間 RNA 雙鏈鏈體獲得的 1~22-nt 長成熟 miRNA 鏈加載到含有 Argonaute 的 RNAISC）中并通過調(diào)控 miRNA 的靶基因表達(dá)水平發(fā)揮作用[5,6]（圖 1）。一個(gè) mRNA，一種 mRNA 可能是許多 miRNA 的靶基因[7,8]。目前，已經(jīng)了超過 700 種 miRNA[9]。

圖 2 IGF-I 的信號(hào)通路[10]IGF-I 可以與 IGF-IR 結(jié)合，，IGF-IR 由四個(gè) α 和兩個(gè) β 亞基組成的四聚體跨膜。IGF-I 配體與 IGF-IR 的結(jié)合通過 IGF-IR 的自身磷酸化導(dǎo)致受體活化。IG種銜接蛋白（包括 IRS 和 Shc）的募集和磷酸化，IGF 受體底物 IRS-1 或 IR PI3K-PDK1-AKT 信號(hào)通路，而 Shc 的磷酸化激活 RAS、RAF 和細(xì)胞外信原活化蛋白激酶信號(hào)通路。通過 PDK1 在蘇氨酸 308 處或 mTORC2 在絲氨酸激活 AKT 通過多種機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞存活，包括抑制細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)促存活基因調(diào)節(jié) GSK-3β 活性和蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞生長[51]，AKT 磷酸化阻斷 GSK3β蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞存活的真核翻譯起始因子 2B（eIF2B）的去磷酸化和活化使結(jié)節(jié)性硬化蛋白（2TSC2）激活，從而激活mTOR1，之后激活S6K和eIF4E釋 eIF4E 可以將核糖體導(dǎo)向 mRNA 的帽結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)帽依賴性翻譯，促進(jìn)蛋白GF-IR 軸的主要功能之一[53]。另一條平行途徑 RAS-RAF-MAPK 刺激細(xì)胞增 miRNA 對(duì) IGF-I 和 IGF-IR 的調(diào)控影響.1 生殖方面
【學(xué)位授予單位】：北京農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S828

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