【摘要】：豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)是目前危害全球養(yǎng)豬業(yè)重要病原之一。研究病毒編碼蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用對于理解PRRSV的致病機制具有十分重要的意義。本研究在篩選、鑒定與PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白11和12(Nsp11、Nsp12)相互作用宿主蛋白的基礎(chǔ)上,進一步選取Galectin-1和Galectin-3為研究目標(biāo),分析了其分別與Nsp11、Nsp12發(fā)生相互作用的生物學(xué)意義,以期為闡明PRRSV的致病機制提供科學(xué)依據(jù)。分別將含有PRRSV Nsp11和Nsp12基因的酵母質(zhì)粒pGBKT7轉(zhuǎn)化酵母菌Y2H Gold進行細(xì)胞毒性和自激活實驗,結(jié)果表明,Nsp1 1和Nsp12基因編碼的蛋白無細(xì)胞毒性和自激活現(xiàn)象。應(yīng)用豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)cDNA文庫和酵母雙雜交技術(shù),分別篩選與Nsp11、Nsp12相互作用的細(xì)胞蛋白,將陽性克隆進行質(zhì)粒提取和測序分析,并在NCBI上進行序列比對,確定相應(yīng)序列對應(yīng)的基因和相互作用的候選蛋白。利用酵母回復(fù)雜交和免疫共沉淀試驗證實Nsp11與Galectin-1、Nsp12與Galectin-3之間存在相互作用。將編碼豬Galectin-1、Galectin-3的基因序列分別克隆入真核載體PCAGGS。過表達(dá)Galectin-1、Galectin-3可顯著抑制不同毒力、不同基因型PRRSV毒株在MARC-145細(xì)胞上的復(fù)制,且Galectin-1的抑制作用更加強烈。進一步研究發(fā)現(xiàn),將原核表達(dá)的Galectin-1蛋白孵育MARC-145細(xì)胞,也可引起PRRSV復(fù)制的顯著抑制,且作用的強弱與Galectin-1蛋白濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。為探討Galectin-1是否具有廣泛的抗病毒作用,過表達(dá)Galectin-1后分別感染馬動脈炎病毒、偽狂犬病毒(PRV)、流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬瘟病毒(CSFV)和乙型腦炎病毒(JEV),結(jié)果顯示,過表達(dá)Galectin-1對PRV、PEDV、CSFV、JEV的復(fù)制呈不同程度的抑制,提示Galectin-1的廣譜抗病毒作用。
【圖文】：

表明Ｎｓｐｌｌ和Ｎｓｐｌ２均不能激活逡逑ＡＵＲ１－Ｃ、ＭＥＬ１報告基因，艮Ｐ無自激活作用（圖２．１Ｂ）。逡逑（Ａ）邐［邋Ｎｓｐｌｌ邋｜邋［邋Ｎｓｐｌ２邋｜邋｜邋ｐＧＢＫＴ７邋｜邋｜邐［邋＋邋｜逡逑＾□ＯＯＱＱ逡逑（Ｂ）逡逑ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／Ｘ／ＡｂＡ邋■逡逑圖２．１誘餌蛋白的毒性（Ａ）和自激活（Ｂ）檢測逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｔｏｘｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐＧＢＫＴ７邋ｐｌａｓｍｉｄｓ．逡逑２．２．２候選蛋白篩選逡逑將轉(zhuǎn)化有ｐＧＢＫＴ７－Ｎｓｐｌｌ、ｐＧＢＫＴ７－Ｎｓｐｌ２的酵母菌株逡逑Ｙ２ＨＧｏｌｄ與轉(zhuǎn)化有ｃＤＮＡ文庫的酵母菌株Ｙ１８７進行接合形逡逑成二倍體細(xì)胞，，涂布于ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／－Ｈｉｓ／Ａｄｅ平板進行初篩，逡逑再將長出菌落點涂到邋ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／－Ｈｉｓ／Ａｄｅ／Ｘ－ａ－Ｇａｌ／ＡｂＡ邋平逡逑板，挑選變藍(lán)的菌落。對藍(lán)色陽性菌落的酵母質(zhì)粒中插入的逡逑片段進行ＰＣＲ鑒定，利用核酸凝膠回收（圖２．２），進行測序逡逑分析和ＢＬＡＳＴ比對。逡逑１４逡逑

表明Ｎｓｐｌｌ和Ｎｓｐｌ２均不能激活逡逑ＡＵＲ１－Ｃ、ＭＥＬ１報告基因，艮Ｐ無自激活作用（圖２．１Ｂ）。逡逑（Ａ）邐［邋Ｎｓｐｌｌ邋｜邋［邋Ｎｓｐｌ２邋｜邋｜邋ｐＧＢＫＴ７邋｜邋｜邐［邋＋邋｜逡逑＾□ＯＯＱＱ逡逑（Ｂ）逡逑ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／Ｘ／ＡｂＡ邋■逡逑圖２．１誘餌蛋白的毒性（Ａ）和自激活（Ｂ）檢測逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｔｏｘｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐＧＢＫＴ７邋ｐｌａｓｍｉｄｓ．逡逑２．２．２候選蛋白篩選逡逑將轉(zhuǎn)化有ｐＧＢＫＴ７－Ｎｓｐｌｌ、ｐＧＢＫＴ７－Ｎｓｐｌ２的酵母菌株逡逑Ｙ２ＨＧｏｌｄ與轉(zhuǎn)化有ｃＤＮＡ文庫的酵母菌株Ｙ１８７進行接合形逡逑成二倍體細(xì)胞，涂布于ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／－Ｈｉｓ／Ａｄｅ平板進行初篩，逡逑再將長出菌落點涂到邋ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／－Ｈｉｓ／Ａｄｅ／Ｘ－ａ－Ｇａｌ／ＡｂＡ邋平逡逑板，挑選變藍(lán)的菌落。對藍(lán)色陽性菌落的酵母質(zhì)粒中插入的逡逑片段進行ＰＣＲ鑒定，利用核酸凝膠回收（圖２．２），進行測序逡逑分析和ＢＬＡＳＴ比對。逡逑１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

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本文編號：2651297