【摘要】：豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV)是目前危害全球養(yǎng)豬業(yè)重要病原之一。研究病毒編碼蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用對于理解PRRSV的致病機(jī)制具有十分重要的意義。本研究在篩選、鑒定與PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白11和12(Nsp11、Nsp12)相互作用宿主蛋白的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步選取Galectin-1和Galectin-3為研究目標(biāo),分析了其分別與Nsp11、Nsp12發(fā)生相互作用的生物學(xué)意義,以期為闡明PRRSV的致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。分別將含有PRRSV Nsp11和Nsp12基因的酵母質(zhì)粒pGBKT7轉(zhuǎn)化酵母菌Y2H Gold進(jìn)行細(xì)胞毒性和自激活實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,Nsp1 1和Nsp12基因編碼的蛋白無細(xì)胞毒性和自激活現(xiàn)象。應(yīng)用豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)cDNA文庫和酵母雙雜交技術(shù),分別篩選與Nsp11、Nsp12相互作用的細(xì)胞蛋白,將陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取和測序分析,并在NCBI上進(jìn)行序列比對,確定相應(yīng)序列對應(yīng)的基因和相互作用的候選蛋白。利用酵母回復(fù)雜交和免疫共沉淀試驗(yàn)證實(shí)Nsp11與Galectin-1、Nsp12與Galectin-3之間存在相互作用。將編碼豬Galectin-1、Galectin-3的基因序列分別克隆入真核載體PCAGGS。過表達(dá)Galectin-1、Galectin-3可顯著抑制不同毒力、不同基因型PRRSV毒株在MARC-145細(xì)胞上的復(fù)制,且Galectin-1的抑制作用更加強(qiáng)烈。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),將原核表達(dá)的Galectin-1蛋白孵育MARC-145細(xì)胞,也可引起PRRSV復(fù)制的顯著抑制,且作用的強(qiáng)弱與Galectin-1蛋白濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。為探討Galectin-1是否具有廣泛的抗病毒作用,過表達(dá)Galectin-1后分別感染馬動脈炎病毒、偽狂犬病毒(PRV)、流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬瘟病毒(CSFV)和乙型腦炎病毒(JEV),結(jié)果顯示,過表達(dá)Galectin-1對PRV、PEDV、CSFV、JEV的復(fù)制呈不同程度的抑制,提示Galectin-1的廣譜抗病毒作用。
【圖文】：

表明Ｎｓｐｌｌ和Ｎｓｐｌ２均不能激活逡逑ＡＵＲ１－Ｃ、ＭＥＬ１報(bào)告基因，艮Ｐ無自激活作用（圖２．１Ｂ）。逡逑（Ａ）邐［邋Ｎｓｐｌｌ邋｜邋［邋Ｎｓｐｌ２邋｜邋｜邋ｐＧＢＫＴ７邋｜邋｜邐［邋＋邋｜逡逑＾□ＯＯＱＱ逡逑（Ｂ）逡逑ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／Ｘ／ＡｂＡ邋■逡逑圖２．１誘餌蛋白的毒性（Ａ）和自激活（Ｂ）檢測逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｔｏｘｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐＧＢＫＴ７邋ｐｌａｓｍｉｄｓ．逡逑２．２．２候選蛋白篩選逡逑將轉(zhuǎn)化有ｐＧＢＫＴ７－Ｎｓｐｌｌ、ｐＧＢＫＴ７－Ｎｓｐｌ２的酵母菌株逡逑Ｙ２ＨＧｏｌｄ與轉(zhuǎn)化有ｃＤＮＡ文庫的酵母菌株Ｙ１８７進(jìn)行接合形逡逑成二倍體細(xì)胞，，涂布于ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／－Ｈｉｓ／Ａｄｅ平板進(jìn)行初篩，逡逑再將長出菌落點(diǎn)涂到邋ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／－Ｈｉｓ／Ａｄｅ／Ｘ－ａ－Ｇａｌ／ＡｂＡ邋平逡逑板，挑選變藍(lán)的菌落。對藍(lán)色陽性菌落的酵母質(zhì)粒中插入的逡逑片段進(jìn)行ＰＣＲ鑒定，利用核酸凝膠回收（圖２．２），進(jìn)行測序逡逑分析和ＢＬＡＳＴ比對。逡逑１４逡逑

表明Ｎｓｐｌｌ和Ｎｓｐｌ２均不能激活逡逑ＡＵＲ１－Ｃ、ＭＥＬ１報(bào)告基因，艮Ｐ無自激活作用（圖２．１Ｂ）。逡逑（Ａ）邐［邋Ｎｓｐｌｌ邋｜邋［邋Ｎｓｐｌ２邋｜邋｜邋ｐＧＢＫＴ７邋｜邋｜邐［邋＋邋｜逡逑＾□ＯＯＱＱ逡逑（Ｂ）逡逑ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／Ｘ／ＡｂＡ邋■逡逑圖２．１誘餌蛋白的毒性（Ａ）和自激活（Ｂ）檢測逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｔｏｘｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐＧＢＫＴ７邋ｐｌａｓｍｉｄｓ．逡逑２．２．２候選蛋白篩選逡逑將轉(zhuǎn)化有ｐＧＢＫＴ７－Ｎｓｐｌｌ、ｐＧＢＫＴ７－Ｎｓｐｌ２的酵母菌株逡逑Ｙ２ＨＧｏｌｄ與轉(zhuǎn)化有ｃＤＮＡ文庫的酵母菌株Ｙ１８７進(jìn)行接合形逡逑成二倍體細(xì)胞，涂布于ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／－Ｈｉｓ／Ａｄｅ平板進(jìn)行初篩，逡逑再將長出菌落點(diǎn)涂到邋ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／－Ｈｉｓ／Ａｄｅ／Ｘ－ａ－Ｇａｌ／ＡｂＡ邋平逡逑板，挑選變藍(lán)的菌落。對藍(lán)色陽性菌落的酵母質(zhì)粒中插入的逡逑片段進(jìn)行ＰＣＲ鑒定，利用核酸凝膠回收（圖２．２），進(jìn)行測序逡逑分析和ＢＬＡＳＴ比對。逡逑１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;我國揭開寨卡病毒復(fù)制奧秘,有助于開發(fā)抗病毒藥物[J];生物學(xué)教學(xué);2017年01期

2 ;科技快遞[J];今日中學(xué)生;2016年33期

3 孔艷;劉逢舉;楊晶;王華信;倪賢珍;;抗HBcIgM和e系統(tǒng)的關(guān)系[J];蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1987年03期

4 趙鈺麟;;HBV-DNA與HBeAg系統(tǒng)作為病毒復(fù)制標(biāo)記的比較[J];國外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊);1987年05期

5 Paul C Z;談小云;;用外源寡核苷酸抑制培養(yǎng)細(xì)胞中愛滋病毒的復(fù)制和表達(dá)[J];藥學(xué)進(jìn)展;1987年04期

6 張玉勤;;英國批準(zhǔn)使用抗AIDS藥AZT[J];國外醫(yī)學(xué)情報(bào);1987年16期

7 駱抗先,林汝洪,黃已實(shí),何世瑤;IgM乙肝核心抗體:反映對病毒復(fù)制的肝內(nèi)炎癥應(yīng)答的標(biāo)志[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1988年03期

8 蘇先獅,鄭宣鶴;乙肝病人血清多聚白蛋白受體與病毒復(fù)制標(biāo)志的關(guān)系[J];湖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1988年04期

9 Rimmer JJ;向建之;;艾滋病的治療和預(yù)防[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1988年01期

10 胡克勤,喻植群,李方和,張永源,郝連杰;乙型肝炎病毒前S蛋白檢測及其與病毒復(fù)制標(biāo)志的關(guān)系[J];上海免疫學(xué)雜志;1989年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 范恒;梁麗;唐慶;胡建莉;廖奕;陳小艷;;慢性乙型病毒性肝炎病毒復(fù)制與肝癌的相關(guān)性研究[A];第二十一屆全國中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會議暨國家級中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病新進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2009年

2 許利軍;吳南屏;;CD38分子和HIV感染的關(guān)系[A];2005年浙江省感染病、肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

3 戴煒;郭亞兵;楊大國;唐蔚;袁靜;王召欽;舒丹;;深圳地區(qū)HBV感染者病毒前C區(qū)變異與病毒復(fù)制水平關(guān)系[A];第九次全國中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2000年

4 王娟華;胡敏濤;吳杭源;蘇婷婷;汪錚;杜合娟;顧錫炳;黃利華;;慢性乙型肝炎患者Th17/Tc17影響病毒復(fù)制和肝細(xì)胞損傷[A];中華醫(yī)學(xué)會第十三次全國感染病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

5 孫正偉;孫向陽;王威;董振芳;;乙型肝炎病毒基因分型與病毒復(fù)制的關(guān)系[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

6 陸偉;張占卿;;血清β2-微球蛋白與慢性肝炎疾病程度和病毒復(fù)制之間的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會全國第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

7 王強(qiáng);汪光蓉;凡瞿明;何蘭;蔡艷娟;毛明;杜琴;張國元;;乙型肝炎病毒核酸相關(guān)抗原在評價(jià)病毒復(fù)制中的應(yīng)用價(jià)值[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

8 呂計(jì)算;阮冰;;乙肝病毒YMDD變異株感染者病毒復(fù)制水平與病情活動的關(guān)系研究[A];2005年浙江省醫(yī)學(xué)病毒學(xué)、醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

9 李艷梅;梁國棟;張仲凱;方榮祥;郝小江;;Glaucogenin C及其苷抑制正鏈RNA病毒復(fù)制活性及其作用機(jī)制研究[A];中國化學(xué)會第二十五屆學(xué)術(shù)年會論文摘要集（下冊）[C];2006年

10 趙孟孟;張桂紅;;針對NSP9基因的siRNA在Marc-145細(xì)胞上對豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第十二次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2016年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 付德明;更昔洛韋治療小兒咽—結(jié)合膜熱[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

2 唐風(fēng);美稱Rab9蛋白與病毒復(fù)制有關(guān)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2005年

3 王永新;矢志岐黃奮進(jìn)創(chuàng)新[N];科技日報(bào);2002年

4 記者 陳建強(qiáng) 通訊員 靳瑩 田宏亮;我科學(xué)家揭開寨卡病毒復(fù)制奧秘[N];光明日報(bào);2016年

5 通訊員 靳瑩 田宏亮 記者 馮國梧;寨卡病毒復(fù)制奧秘揭開[N];科技日報(bào);2016年

6 記者 瞿劍;宿主蛋白抑制流感病毒復(fù)制奧秘解開[N];科技日報(bào);2018年

7 記者 劉海英 張夢然;兩種藥物組合可防寨卡病毒復(fù)制[N];科技日報(bào);2016年

8 毛磊;阻止非典病毒復(fù)制鼠可“自產(chǎn)”抗體[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

9 中證證券研究中心;重啤疫苗抑制病毒復(fù)制無顯著優(yōu)勢[N];中國證券報(bào);2012年

10 ;抗丙肝新藥可抑制病毒復(fù)制[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李麗薇;Galectin-1和Galectin-3調(diào)控豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的相關(guān)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

2 許海旭;新城疫病毒M蛋白功能性氨基酸突變和M蛋白與膜聯(lián)蛋白A6互作影響病毒復(fù)制分子機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

3 邱敏;鋅離子載體抗單純皰疹病毒機(jī)制研究及泛素—蛋白酶體通路與病毒復(fù)制的關(guān)系初步探討[D];南京大學(xué);2014年

4 劉長龍;豬繁殖與呼吸綜合征病毒3’非編碼區(qū)對病毒復(fù)制調(diào)控作用解析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

5 譚菲菲;豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白在病毒復(fù)制過程中的作用研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

6 文雪霞;宿主細(xì)胞蛋白p21和ILF2調(diào)控豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的分子機(jī)制[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

7 紀(jì)冬;乙型肝炎病毒多聚酶區(qū)基因突變的監(jiān)測與突變對病毒復(fù)制力影響的分析[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2010年

8 萬玉立;甲型流感病毒感染A549細(xì)胞的表達(dá)譜分析及相關(guān)基因功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2009年

9 郝洪平;氯化鋰抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制機(jī)制的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 朱鵬陽;運(yùn)輸?shù)鞍讖?fù)合物6A亞基（TRAPPC6A）調(diào)控流感病毒復(fù)制機(jī)制研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 郭振東;宿主miRNA抑制A型流感病毒復(fù)制的作用研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2013年

2 郇貝麗;豬血清淀粉樣蛋白3對豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的影響[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

3 李陽;RNAi抑制SARS病毒復(fù)制與感染的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 李治;抑癌基因Arid2對HBV病毒復(fù)制的調(diào)控及分子機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

5 李亮亮;豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5與細(xì)胞凋亡和病毒復(fù)制關(guān)系的初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

6 董春艷;miR-9與MCPIP1互作對流感病毒復(fù)制的影響[D];吉林大學(xué);2016年

7 李瀅;慢性乙型肝炎病毒感染病毒復(fù)制與肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)性的初步探討[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2013年

8 韓燕;親環(huán)素A對豬乙型腦炎病毒復(fù)制的影響[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

9 王曉紅;GP5~(Δ84-119)穩(wěn)定表達(dá)對豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的影響及其機(jī)制的初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

10 王娟娟;哺乳動物上皮細(xì)胞中鞘糖脂在登革病毒感染中的作用[D];蘇州大學(xué);2015年

本文編號：2651297