【摘要】：豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)和豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)是豬群中常見的兩種病毒,在世界范圍內(nèi)廣泛流行并能夠引起多種豬的疾病,對養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。PCV是單鏈環(huán)狀DNA病毒,自1974年首次發(fā)現(xiàn)PCV1以來,目前在豬群中流行的基因型有3種,其中PCV2對豬群有較強的致病性。PCV3是2016年首次在美國的母豬流產(chǎn)胎兒當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的,同PCV2相比較二者之間Cap基因的同源性較低,由于PCV3是一種新的PCV基因型,目前關(guān)于PCV3流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)和檢測方法還不是很完善。SIV是分8個基因片段的負(fù)鏈RNA病毒,在豬群中主要流行的基因型為H1N1、H1N2和H3N2,由于不同來源的流感病毒能夠在豬體內(nèi)發(fā)生重組且流感病毒可以從豬傳播到人群中,因此對于SIV的流行病學(xué)調(diào)查及致病性研究具有重要的獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究對2016至2018年間山東省、天津市和上海市及周邊地區(qū)豬場中疑似豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的病料進行采集處理,通過建立PCV2和PCV3雙重PCR方法對采集病料進行檢測,發(fā)現(xiàn)PCV3的陽性率為32.7%且存在PCV2和PCV3混合感染的情況(PCV2和PCV3混合感染的陽性率為15.2%)。表明PCV3目前已經(jīng)在豬群中廣泛流行。將陽性病料接種PK-15細(xì)胞進行病毒分離實驗,只成功分離鑒定到2株P(guān)CV2毒株。對代表毒株遺傳演化分析,結(jié)果顯示分離到的兩株P(guān)CV2屬于PCV2b-1A和PCV2b-1C兩個亞型,7株不同地區(qū)PCV3代表毒株屬于PCV3a亞型,與GenBank中登錄的PCV3序列的全長與Cap基因的同源性分別為97.6%-99.4%和97.1%-99.1%。為探究PCV3 Cap蛋白抗原性,本研究通過原核表達方式,獲得了可溶性表達的去核定信號肽重組蛋白pCold TF-dPCV3-Cap,通過Western blot實驗證明該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性和特異性。為制備針對于PCV3 Cap的單克隆抗體,本研究利用構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pCAGGS-PCV3-Cap免疫小鼠,細(xì)胞融合后進行陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選和亞克隆純化,經(jīng)間接免疫熒光鑒定,結(jié)果顯示有3株雜交瘤細(xì)胞株上清能夠與PCV3 Cap蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),其中一株3G10的反應(yīng)效果最好。為了解豬流感病毒的流行情況及其致病性,本研究對2018年于山東某豬場采集到的病料進行分離鑒定,獲得3株二源重組H1N1 SIV,遺傳演化分析結(jié)果表明,其兩個表面基因HA和NA來源屬于歐洲類禽亞型,其他6個內(nèi)部基因的來源屬于2009年甲型流感病毒。為探究分離到的毒株對哺乳動物的致病性,本研究將代表毒株A/Swine/Shandong/L1/2018(H1N1)在小鼠模型上進行滴鼻感染攻毒實驗,結(jié)果顯示代表毒株對小鼠呈現(xiàn)較高的致病性,能夠?qū)е滦∈篌w重產(chǎn)生明顯下降,小鼠死亡率為100%;代表毒株能夠在小鼠肺臟中很好地復(fù)制,病毒感染對小鼠肺臟產(chǎn)生明顯的組織病理學(xué)損傷。
【圖文】：

圖 2.1 雙重 PCR 不同退火溫度擴增結(jié)果.2.1 Effect of annealing temperature on detection of two viruses by double P(DL2000); 1: 50 C; 2: 52 C; 3: 54 C; 4: 56.4 C; 5: 58.8 C; 6: 61.2 C; 7: 6310: 70 C; 11: 陰性對照L2000); 1: 50 C; 2: 52 C; 3: 54 C; 4: 56.4 C; 5: 58.8 C; 6: 61.2 C; 7: 63.6

圖 2.2 雙重 PCR 不同循環(huán)數(shù)擴增結(jié)果Fig. 2.2 Effect of number of cycles of double PCR分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: 25 個循環(huán); 2: 30 個循環(huán); 3: 35 個循環(huán); 4: 40 個A Marker (DL2000); 1: 25 cycles; 2: 30 cycles; 3: 35 cycles; 4: 40 cycles; 5:
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.651

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本文編號：2648717