【摘要】：旋毛蟲(chóng)病是最重要的食源性人畜共患疾病之一,分布于世界各地。旋毛蟲(chóng)病不僅會(huì)造成重大經(jīng)濟(jì)損失,還危及人類(lèi)健康。本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)探究旋毛蟲(chóng)谷氨酰胺依賴(lài)性抗酸機(jī)制的重要性。通過(guò)浸泡法將三條特異性的TsGLS-siRNA導(dǎo)入旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng),篩選出一條沉默效果最佳的TsGLS-siRNA;將轉(zhuǎn)染siRNA的肌幼蟲(chóng)放在pH2.5、pH4、pH6.6、pH9的培養(yǎng)液中,從存活率、基因表達(dá)水平、蟲(chóng)體酶活性、培養(yǎng)液pH變化、Gln缺失等檢測(cè)TsGLS基因沉默對(duì)肌幼蟲(chóng)耐酸能力的影響;將轉(zhuǎn)染siRNA的肌幼蟲(chóng)經(jīng)口接種小鼠,觀察TsGLS基因沉默對(duì)肌幼蟲(chóng)胃液內(nèi)耐酸能力、肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率以及子一代耐酸能力的影響。通過(guò)基因水平和蛋白水平分析,siRNA-881組肌幼蟲(chóng)TsGLS表達(dá)量比PBS組分別降低72.82%和55.44%,成功從三條TsGLS-siRNA篩選出干擾效果最佳的siRNA-881。TsGLS基因沉默對(duì)肌幼蟲(chóng)體外抗酸能力影響檢測(cè)中,存活率結(jié)果顯示,在pH2.5、2 h時(shí)存活率明顯低于其他酸性環(huán)境下,siRNA-881組肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率僅為PBS對(duì)照組的48.33%。蟲(chóng)體酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示,在pH2.5、0.5 h時(shí)谷氨酰胺酶活性最高,為1.67 U/mg,pH4次之,pH9時(shí)沒(méi)有活性。培養(yǎng)液pH變化結(jié)果顯示,通過(guò)pH計(jì)測(cè)量培養(yǎng)溶液的pH值,并且當(dāng)培養(yǎng)溶液起始pH為pH4時(shí),pH變化最顯著。在pH4環(huán)境中培養(yǎng)1 h,與PBS組相比,siRNA-881干擾后pH值上升低了1.7,且隨著時(shí)間增長(zhǎng),差距越小。通過(guò)檢測(cè)谷氨酰胺的缺失對(duì)抗酸能力的影響,結(jié)果顯示,體外添加10μM谷氨酰胺能提高TsGLS基因表達(dá),且siRNA-881沉默TsGLS效果好于BPTES。TsGLS基因沉默對(duì)肌幼蟲(chóng)體內(nèi)抗酸能力影響檢測(cè)中,用轉(zhuǎn)染siRNA的肌幼蟲(chóng)接種小鼠后,檢測(cè)7 d成蟲(chóng)減蟲(chóng)率和35 d肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率分別為61.64%和66.71%。檢測(cè)其保姆細(xì)胞厚度結(jié)果顯示,與PBS組相比,siRNA-881組(15.90±1.301)厚度降低了39.78%。siRNA處理肌幼蟲(chóng)TsGLS基因沉默遺傳性分析,與親代相比,子一代的基因表達(dá)量較親代降低32.70%。由此證明,旋毛蟲(chóng)具有谷氨酰胺依賴(lài)性抗酸系統(tǒng),利用RNA干擾技術(shù)也已明顯降低肌幼蟲(chóng)抗酸能力。為了評(píng)價(jià)旋毛蟲(chóng)TsGLS、TsGAD重組蛋白誘導(dǎo)小鼠的免疫保護(hù)效果,分別將TsGLS、TsGAD、TsGLS+TsGAD重組蛋白分別與佐劑混勻免疫BALB/c小鼠后,檢測(cè)血清中特異性抗體水平的變化,并檢測(cè)重組蛋白體外刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平;在加強(qiáng)免疫小鼠后,通過(guò)攻擊試驗(yàn)檢測(cè)并比較7天成人和35天肌肉幼蟲(chóng)的蠕蟲(chóng)減少率,以及免疫小鼠在攻蟲(chóng)后第7、14、21、35天產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平。血清中特異性抗體檢測(cè)結(jié)果顯示,用TsGLS和TsGAD重組蛋白免疫的小鼠可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生混合的Th1/Th2免疫應(yīng)答,每個(gè)免疫組血清中IgG、IgG_1、IgG_(2a)檢測(cè)結(jié)果顯示,IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗體水平均有所增加,且以IgG_1(Th2)的抗體水平增加最顯著。增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)TsGLS和TsGAD重組蛋白刺激后,脾淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加,以TsGAD重組蛋白刺激最顯著。ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞因子分泌情況結(jié)果顯示,IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10含量均顯著增加。ELISA檢測(cè)血清中細(xì)胞因子結(jié)果顯示,IL-4和IL-10的水平在攻擊后第14天達(dá)到最高水平,IFN-γ和IL-12水平在攻蟲(chóng)后第7天達(dá)到最高。攻蟲(chóng)試驗(yàn)結(jié)果顯示,TsGLS、TsGAD和TsGLS+TsGAD小鼠中的成蟲(chóng)和肌肉幼蟲(chóng)為35.55%、49.24%、37.34%和47.05%、60.01%、46.55%。上述研究結(jié)果表明,TsGLS和TsGAD重組蛋白均能誘導(dǎo)小鼠獲得免疫保護(hù)效果,且TsGAD重組蛋白免疫效果最佳。兩部分實(shí)驗(yàn)表明,旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)具有谷氨酰胺依賴(lài)性抗酸系統(tǒng),利用RNA干擾技術(shù)也已明顯降低肌幼蟲(chóng)抗酸能力,為預(yù)防旋毛蟲(chóng)病提供了一條新思路。谷氨酰胺酶可以作為一種候選旋毛蟲(chóng)病疫苗。
【圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文果 siRNA 導(dǎo)入到旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)體內(nèi)浸泡法將熒光標(biāo)記的 Control siRNA 轉(zhuǎn)染到旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)體內(nèi)，并分別在 顯微鏡觀察。圖 3-1 中顯示，6 h 時(shí)只有少量肌幼蟲(chóng)有熒光信號(hào)，12 h 時(shí)轉(zhuǎn)上，說(shuō)明浸泡 12 h 后，Control siRNA 已經(jīng)被成功導(dǎo)入到旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)體到實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。在熒光顯微鏡下明顯觀察到熒光信號(hào)主要集中于旋毛蟲(chóng)小腸ol siRNA 可能為旋毛蟲(chóng)吞食進(jìn)入體內(nèi)。

-2 siRNA 處理后旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng) TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平xpression level of TsGLS in Trichinella spiralis muscle treatmentot 在蛋白水平檢測(cè) siRNA 對(duì) TsGLS 表RNA-881、siRNA-1429 分別轉(zhuǎn)染到肌幼蟲(chóng)體內(nèi)，在平檢測(cè)。與 PBS 對(duì)照組相比，siRNA-419、siRNA別降低 7.74%、55.44%、35.52%，而 Control siRNA組（P>0.05），見(jiàn)圖 3-3。siRNA-881 對(duì) TsGLS 表達(dá) 檢測(cè) TsGLS mRNA 表達(dá)量結(jié)果相一致。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蔡永生;鄭鐵魁;;氟化鈉與茶葉水對(duì)牙質(zhì)粉抗酸能力的比較[J];茶葉;1982年03期

2 陳菲,馮祖德,林昌健;氟離子濃度對(duì)二水磷酸氫鈣在水溶液中的轉(zhuǎn)化及其產(chǎn)物抗酸能力的影響[J];廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2001年01期

3 周舒 ,黃國(guó)健;人體必需微量元素之十、十一——氟與氯[J];中老年保健;1999年04期

4 朱玉華;茶水漱口防齲效果好[J];幼兒教育;1987年03期

5 劉艷春;;微生物發(fā)酵飼料在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J];中國(guó)畜牧業(yè);2015年04期

6 宋貴倫 ,宋智勤 ,周強(qiáng);正確選用胃藥[J];農(nóng)家參謀;1994年11期

7 Stewart M.Beekman;劉國(guó)華;;新胃抗酸劑的制備及性質(zhì)(一) 氫氧化鋁——碳酸鎂干凝膠[J];南藥譯叢;1961年Z1期

8 ;用茶水煮飯可防四種疾病[J];健康必讀;2006年07期

9 金燕;葛自力;黃希;;掃描電鏡觀察碳酸氫鈉溶液對(duì)牙釉質(zhì)抗酸能力的影響[J];蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年06期

10 張道楔;氟離子透入防齲新技術(shù)[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;1987年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 劉紅心;王文輝;劉敏;;對(duì)兒童使用氟泡沫防齲可能出現(xiàn)的問(wèn)題及對(duì)策[A];全國(guó)兒科護(hù)理學(xué)術(shù)交流暨專(zhuān)題講座會(huì)議論文匯編[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 長(zhǎng)沙市口腔醫(yī)院 郭錦材;“飯后漱口”有講究[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2018年

2 ;茶水燒飯可防疾病[N];重慶商報(bào);2000年

3 曉肖;茶水煮飯,好吃又防病[N];人民政協(xié)報(bào);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 孟詩(shī);TsGLS基因沉默對(duì)旋毛蟲(chóng)抗酸能力及其蛋白免疫保護(hù)研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

2 劉剛;六周高原訓(xùn)練對(duì)上海市1500m運(yùn)動(dòng)員專(zhuān)項(xiàng)能力的影響與分析[D];上海體育學(xué)院;2013年

3 張海坤;對(duì)男子1500米專(zhuān)項(xiàng)乳酸能力訓(xùn)練及如何戰(zhàn)勝“速度型”選手的研究[D];上海體育學(xué)院;2015年

，

本文編號(hào)：2648373