【摘要】：脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白,又稱(chēng)為脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)或aP2,是脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)家族中的一員,能結(jié)合多種疏水性化合物,在脂肪和卵巢組織中分布廣泛,參與脂肪酸的合成代謝,作用于卵巢組織,調(diào)控禽類(lèi)產(chǎn)蛋過(guò)程中蛋的脂肪酸營(yíng)養(yǎng)沉積,從而對(duì)禽類(lèi)產(chǎn)蛋中脂肪酸的沉積起到重要作用,有利于產(chǎn)蛋性能的提高。課題組前期篩選差異表達(dá)蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn),產(chǎn)蛋高峰期豁眼鵝FABP4的表達(dá)量升高。鑒于此,本研究選取鵝卵泡顆粒細(xì)胞,探討FABP4對(duì)鵝卵泡顆粒細(xì)胞生殖激素分泌的影響,為揭示FABP4對(duì)禽類(lèi)產(chǎn)蛋性能的作用及機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。本研究首先構(gòu)建FABP4基因的真核表達(dá)載體。通過(guò)采集豁眼鵝卵巢組織提取組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴(kuò)增后得到FABP4基因的目的片段,連接轉(zhuǎn)化后構(gòu)建克隆載體pMD18T-FABP4,雙酶切后將FABP4基因片段連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1上,構(gòu)建pcDNA3.1-FABP4過(guò)表達(dá)載體;然后,分離培養(yǎng)原代豁眼鵝卵泡顆粒細(xì)胞,利用該細(xì)胞進(jìn)行FABP4基因的干擾和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染試驗(yàn),分成空白,陰性對(duì)照,FABP4-siRNA干擾,pcDNA3.1-FABP4過(guò)表達(dá)這四個(gè)試驗(yàn)組,采集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞上清液用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法驗(yàn)證FABP4對(duì)雌二醇(E_2)和孕酮(P_4)的影響,并在mRNA和蛋白表達(dá)水平上探討FABP4對(duì)鵝卵巢激素合成和分泌相關(guān)基因CYP11A1和CYP19A1的影響,從而探討FABP4對(duì)豁眼鵝產(chǎn)蛋性能影響的分子基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果為:(1)成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-FABP4;(2)成功分離出豁眼鵝卵泡顆粒細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng);(3)成功轉(zhuǎn)染FABP4-siRNA干擾引物和pcDNA3.1-FABP4過(guò)表達(dá)載體進(jìn)入豁眼鵝卵泡顆粒細(xì)胞中;(4)所采集的細(xì)胞上清液中E_2和P_4含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),RNA干擾組顯著低于空白組和陰性對(duì)照組(P0.05),過(guò)表達(dá)組顯著高于空白組和陰性對(duì)照組(P0.05);(5)檢測(cè)CYP11A1和CYP19A1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),RNA干擾組均顯著低于對(duì)照組(P0.05),過(guò)表達(dá)組均顯著高于對(duì)照組(P0.05)。本研究結(jié)果表明,FABP4可通過(guò)干預(yù)CYP11A1和CYP19A1的表達(dá),影響體外培養(yǎng)的鵝卵泡顆粒細(xì)胞E_2和P_4的分泌。
【圖文】：

2016）。形不斷變化，按照原始卵泡、生長(zhǎng)卵泡和2014）。原始卵泡是卵泡發(fā)育的初級(jí)階段在皮細(xì)胞組成，該卵泡發(fā)育成下一階段，即的初級(jí)卵泡（A. Johnson et al.，2007）。生此階段較原始卵泡有很多變化，卵黃開(kāi)始大激增，外周逐漸膨脹變大，卵泡外層產(chǎn)上皮組織，此時(shí)形成的卵泡是次級(jí)卵泡（熟卵泡是卵泡發(fā)育的最后一個(gè)階段，此時(shí)經(jīng)成型不再分層，個(gè)體變得更大，并完全于卵巢組織上，卵泡柄是卵泡輸送營(yíng)養(yǎng)物分方式

圖 1-2 RNA 干擾原理圖（引自ike.baidu.com/pic/RNA%E5%B9%B2%E6%89%B0/3743635/0/08f790529822720e17f21fab54?fr=lemma&ct=single#aid=0&pic=08f790529822720e1782f5d579cb0a46f21Fig 1-2 RNA interference principle (fromike.baidu.com/pic/RNA%E5%B9%B2%E6%89%B0/3743635/0/08f790529822720e17f21fab54?fr=lemma&ct=single#aid=0&pic=08f790529822720e1782f5d579cb0a46f2Ai 的特性及優(yōu)勢(shì)Ai 的特性主要有五個(gè)方面：① 整個(gè)過(guò)程發(fā)生在轉(zhuǎn)錄之后，所以沒(méi)有翻反應(yīng)的進(jìn)行；② 因工作原理針對(duì)于內(nèi)源 mRNA 片段便可達(dá)到較高的沉默目的 mRNA 片段的效果；③ 在 Dicer 酶的解離下 dsRNA 被酶較少的核苷酸序列就能起到沉默目的基因的表達(dá)，使基因結(jié)構(gòu)發(fā)生變高效；④ 任何反應(yīng)都需要時(shí)間來(lái)進(jìn)行，對(duì)基因的沉默反應(yīng)同樣如此的前提下，，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 siRNA 需要 36~48h 達(dá)到干擾效果；⑤ 由于干核中作用于 mRNA 片段上，在成功沉默目的基因后，伴隨細(xì)胞的有干擾的片段是可以將沉默效果延續(xù)給子代，因此該手段具有延續(xù)性（唐
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S835

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2648123