【摘要】：小花棘豆(Oxytropis glabra)為多年生棘豆屬草本植物,其體外分離培養(yǎng)得到的Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌可生成有毒生物堿苦馬豆素(swainsonine,SW),牲畜取食至一定量,出現(xiàn)中毒癥狀,引起細胞功能紊亂,嚴重者致死,給畜牧業(yè)帶來極大損失。而酵母氨酸還原酶(Sac)在內(nèi)生真菌中合成SW代謝途徑中起到關(guān)鍵作用。本研究以Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌OW7.8菌株為研究對象,管家基因ACTIN、TUB、GAPDH、APRT、18S rRNA為候選內(nèi)參基因進行qRT-PCR,Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper軟件共同進行分析評價,篩選內(nèi)生真菌最適的內(nèi)參基因;在不同培養(yǎng)時間、添加不同前體物(a-氨基己二酸(L-A)、賴氨酸(L-Lys)、哌啶酸(L-P))及不同前體物濃度(0 mol/L、1×10~-33 mol/L、3×10~-44 mol/L、1×10~-44 mol/L和1×10~-55 mol/L)條件下,利用HPLC-MS檢測內(nèi)生真菌SW動態(tài)水平、利用qRT-PCR分析酵母氨酸還原酶基因(sac)的表達;克隆sac啟動子序列,構(gòu)建其表達載體pBARGPEI-mCherry-sac,并進行轉(zhuǎn)錄激活功能的檢測;提取內(nèi)生真菌的Sac,對其酶活、最適pH值、最適溫度、酶動力學、K_m和V_(max)值等基礎(chǔ)酶學性質(zhì)進行分析。為探索內(nèi)生真菌中sac對SW合成的影響提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌的最適內(nèi)參基因為ACTIN。2.添加L-A、L-Lys和L-P的實驗組真菌的SW水平和sac表達量均高于對照組。sac表達與SW水平呈對應(yīng)關(guān)系:sac表達量高,SW水平高;sac表達量低,則SW水平低。添加相同濃度L-Lys、L-A及L-P(1×10~(-4)mol/L)后,真菌SW水平和sac表達量分別在23d、26d和32d達最大值;培養(yǎng)26d而L-A的添加濃度為3×10~-44 mol/L、培養(yǎng)23d而L-Lys添加濃度為1×10~-44 mol/L、培養(yǎng)32d而L-P的添加濃度為1×10~(-4) mol/L時,內(nèi)生真菌SW水平和sac表達量分別為最高。添加相同濃度的L-Lys、L-A和L-P(1×10~(-4) mol/L)時,L-Lys添加組在培養(yǎng)23d時真菌SW水平和sac表達量高于L-A和L-P添加組;而L-P添加組在培養(yǎng)26d、29d和32d時真菌SW水平和sac表達均高于L-A和L-Lys添加組。3.利用TAIL-PCR法克隆到sac啟動子序列,經(jīng)PLACE和BDGP在線軟件進行功能元件預(yù)測,發(fā)現(xiàn)含TATA-box、CAAT-box、G-box和7個與脅迫相關(guān)的作用元件。構(gòu)建pBARGPEI-mCherry-sac啟動子表達載體,并將該表達載體轉(zhuǎn)化至OW7.8原生質(zhì)體,經(jīng)再生培養(yǎng)得sac啟動子轉(zhuǎn)錄激活功能株(抗草胺磷),經(jīng)PCR檢測到融合目的序列,經(jīng)RT-PCR檢測到mCherry基因的轉(zhuǎn)錄,在熒光顯微鏡(紅光)下檢測到菌株有紅色熒光,而野生株OW7.8無,說明sac啟動子實現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄激活功能。4.提取OW7.8的Sac,其最適pH值為7.0;最適反應(yīng)溫度為24℃;最適反應(yīng)時間為10 min;當?shù)孜颪ADP~+不變時,酵母氨酸最適濃度為1mmol/L、Sac的K_m=0.118 mmol/L、V_(max)=0.063μmol/min;當?shù)孜锝湍赴彼岵蛔儠r,NADP~+最適濃度為2 mmol/L,Sac的K_m=0.375 mmol/L、V_(max)=0.213μmol/min。
【圖文】：

ccharopine reductase;Sac)，催化 α-氨基己二酸半醛生成酵母氨酸(L-saccharopine) 是 種有毒生物堿又名吲哚茲定三醇(indolizidine triol)，化學式是 C8H15NO3[6legate 等在 1979 年首次從灰苦馬豆(Swainsona canescens)中分離得到 SW[6]。盧在內(nèi)蒙古不同地區(qū)的小花棘豆中分離得到 SW[17]。Harris等1988年對豆科絲核菌(Rhixoctonia leguminicola)中的SW生物合成途徑了推測，提出以下主要通路：賴氨酸(L-lysine；L-Lys)→酵母氨酸→L-2-氨基己半醛(L-2-Aminoadidpic acid,L-A)→1,6-二六氫哌啶酸(△1-piperideine-6 carboxylC)→2-六氫哌啶酸(哌啶酸，L-Pipecolic acid；L-P)→1-酮基吲哚里西啶，隨后分過順式羥基吲哚里西啶和反式羥基吲哚里西啶兩條途徑分別生成根霉菌氨和SW著Wickwire等在1990年對代謝途徑進行深入研究提出SW代謝途徑可能是： 賴氨酸氧化酶酵母氨酸SacL-2-氨基己二酸半醛構(gòu)型變化1,6-二六氫哌啶酸1,6-二六氫哌啶酸還原酶酸+丙二酸乙二酸哌啶還原、環(huán)化1-羥基吲哚里西啶還原、羥化1,2,8-3羥基吲哚里西)[19]。豆科絲核菌中SW合成代謝途徑如圖1-1。

圖 1-2 M.anisopliae 中 SW 合成代謝途徑Fig1-2 SW Metabolic Pathway in M.anisopliae2012年通過標記賴氨酸的C、N進行示蹤實驗，發(fā)現(xiàn)加α-酮戊二酸、賴氨酸和哌啶酸對SW動態(tài)水平研的內(nèi)生真菌中SW水平高于未添加的實驗對照組[21酸、賴氨酸、哌啶酸和聚乙二醇對內(nèi)生真菌生長不[22]。在 2014 年對內(nèi)蒙古的 O.glabra 體外分離得到內(nèi)生A序列(NCBI登錄號:KJ944635)，簡并PCR克隆到s048)，，與從美國瘋草內(nèi)生真菌的 sac 的 cDNA 序列 失載體[23]，獲得 sac 缺失突變株 M1[24]，通過 Sou間片段已被敲除，且 hph 整合到 M1 的基因組中到酵母氨酸含量在 M1 中低于 OW7.8[26]。接著課題
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S812.6

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 趙利娜;盧萍;;酵母氨酸還原酶影響真菌中苦馬豆素的合成[J];綠色科技;2019年10期

2 薩如拉;席領(lǐng)軍;盧萍;高峰;杜玲;;不同添加物對小花棘豆內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因缺失突變株M1合成苦馬豆素的影響[J];生命科學研究;2018年04期

3 權(quán)海云;任禎慧;路浩;王帥;薛瑞旭;王建國;吳晨晨;趙寶玉;;苦馬豆素研究最新進展[J];中國獸醫(yī)學報;2017年08期

4 本刊訊;;中科院遺傳發(fā)育所揭示人類Ⅱ型高賴氨酸血癥發(fā)病機理[J];首都食品與醫(yī)藥;2019年02期

相關(guān)會議論文 前1條

1 盧萍;王思遠;高峰;呼吉雅;哈布拉;;小花棘豆Embellsia內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因克隆及其敲除突變體構(gòu)建[A];遺傳多樣性：前沿與挑戰(zhàn)——中國的遺傳學研究（2013-2015）——2015中國遺傳學會大會論文摘要匯編[C];2015年

相關(guān)碩士學位論文 前6條

1 趙利娜;Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因表達分析及其啟動子克隆[D];內(nèi)蒙古師范大學;2019年

2 薩如拉;小花棘豆Alternaria oxytropis內(nèi)生真菌苦馬豆素合成代謝中酵母氨酸還原酶基因的影響[D];內(nèi)蒙古師范大學;2018年

3 席領(lǐng)軍;酵母氨酸還原酶基因?qū)π』箖?nèi)生真菌苦馬豆素合成代謝的影響[D];內(nèi)蒙古師范大學;2017年

4 王思遠;小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因的克隆及其缺失載體的構(gòu)建[D];內(nèi)蒙古師范大學;2014年

5 哈布拉;小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因?qū)囫R豆素合成影響的研究[D];內(nèi)蒙古師范大學;2016年

6 呼吉雅;小花棘豆Embellisia內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因缺失突變株的構(gòu)建及篩選鑒定[D];內(nèi)蒙古師范大學;2015年

本文編號：2646859