【摘要】：肝炎-心包積液綜合征(Hepatitis and Hydropericardium Syndrome,HHS)是一種家禽急性傳染性疾病,嚴重影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展。2015年6月份以來,我國暴發(fā)由禽腺病毒4型(Fowl Aviadenovirus 4,FAdV-4)新基因型引起的HHS,對我國養(yǎng)禽業(yè)造成很大損失。目前該病仍不斷發(fā)生,市場上尚無正規(guī)商品化疫苗進行預(yù)防,并且對疫苗的免疫反應(yīng)缺乏客觀的評價方法。本研究從河南及周邊各省采集患病雞只肝臟,進行病毒分離鑒定和基因組序列測定與分析,研究分離毒株的生物學特性;建立基于FAdV-4中國流行株間接ELISA抗體的檢測方法;制備基于FAdV-4中國流行株的油乳劑滅活疫苗,對疫苗的免疫原性和免疫效力進行評價,研究內(nèi)容包括以下4個方面:1.FAdV-4中國流行株分離鑒定與基因進化分析本研究從河南、山東、山西、安徽和江蘇等省份暴發(fā)HHS的雞場采集樣品,進行病毒分離并測定五株分離株的全基因組序列。通過生物學軟件進行核苷酸序列和氨基酸序列分析及病毒的系統(tǒng)進化分析。結(jié)果顯示,中國流行株與早期的致病和非致病毒株相比,FAdV-4中國流行毒株基因組右端存在1966bp的缺失,這一缺失直接導致了ORF19、27和48的消失;Hexon、Penton、Fiber蛋白均在特定位置發(fā)生氨基酸殘基的替換;進化樹分析顯示,分離自世界各地HHS病雞的FAdV-4親緣關(guān)系較近,均在同一進化分支,而非致病毒株集中在另一分支。引起本次肝炎-心包積液綜合征的FAdV-4為新基因型。2.FAdV-4中國流行毒株CH/HNJZ/2015生物學特性研究為進一步了解FAdV-4中國流行毒株CH/HNJZ/2015生物學特性,利用SYBR Green I實時熒光定量PCR和病毒滴度測定方法,研究該毒株在雞肝癌上皮細胞系(LMH)中的生長特性和增殖規(guī)律。結(jié)果顯示FAdV-4中國流行株在LMH中能夠很好增殖,不同時間點的病毒滴度與病毒基因組拷貝數(shù)呈正相關(guān),病毒感染后60 h滴度最高,且培養(yǎng)上清中亦含有大量成熟的病毒粒子;將毒價為10~7TCID_(50)的FAdV-4中國流行株CH/HNJZ/2015經(jīng)肌肉注射途徑感染3周齡SPF雞,死亡率100%,采集組織器官制備病理切片進行HE染色和免疫組化,結(jié)果顯示攻毒雞各組織器官均有不同程度的損傷,肝臟、心臟、脾臟、腺胃和小腸組織中均有病毒抗原,證明該分離株為強毒株。3.基于FAdV-4中國流行株間接ELISA方法的建立與應(yīng)用為建立一種客觀評價雞群中FAdV-4流行毒株感染情況和FAdV-4全病毒滅活疫苗免疫后抗體反應(yīng)的簡便、快速和特異的方法,本研究利用純化的禽腺病毒4型(FAdV-4)中國流行株作為包被抗原,建立了檢測FAdV-4流行株抗體的間接ELISA方法,并對各種檢測條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:抗原的最佳包被量為0.20μg/孔;包被條件為37℃1 h,然后4℃過夜;血清稀釋度為1:800,酶標二抗最適稀釋度為1:2 000,作用時間為1.5h;TMB作用時間為5 min。在優(yōu)化條件下,樣品的S/P值大于或等于0.073時判定為陽性。FAdV-4抗原與抗新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、減蛋綜合征病毒陽性血清均無交叉反應(yīng),表明該方法有較好的特異性;批內(nèi)和批間重復(fù)的最大變異系數(shù)分別為3.864%和3.924%,顯示該方法具有較好的穩(wěn)定性,用所建立的ELISA對40份來自于疑似FAdV-4感染病雞的血清樣品進行檢測,檢測結(jié)果與FAdV-4病原學檢測結(jié)果符合率為100%。對我國河南、山東、安徽、山西和江蘇等不同地區(qū)的676份雞血清樣品進行了FAdV-4感染的血清流行病學調(diào)查,結(jié)果顯示上述省份均存在不同程度的FAdV-4感染,抗體陽性率在69.3-89.1%。4.基于FAdV-4中國流行株滅活疫苗的研制與評價為有效防控HHS在中國的流行,本研究利用LMH細胞對FAdV-4中國流行株進行增殖,制備油乳劑滅活疫苗。用不同劑量的滅活疫苗接種7日齡SPF肉雞,檢測疫苗免疫雞的FAdV-4特異性抗體水平和中和抗體,分析疫苗免疫原性。在免疫后2周對免疫雞用10~3TCID_(50)/雞的FAdV-4中國流行株經(jīng)肌肉注射途徑攻毒,以評價滅活疫苗的免疫效力。結(jié)果顯示,不同劑量的疫苗免疫雞均產(chǎn)生FAdV-4特異性抗體和中和抗體,抗體水平在免疫后2周開始上升,4周后達到高峰期,且在免疫后20周依然維持很高水平,各免疫組雞在攻毒后均未表現(xiàn)HHS特征性臨床癥狀和病理變化及死亡。本研究結(jié)果顯示,基于FAdV-4中國流行株滅活疫苗能夠有效防控由FAdV-4新基因型導致的HHS。
【圖文】：

圖 1 禽腺病毒粒子結(jié)構(gòu)示意圖Fig1. Diagram of FAdV virion可以通過 0.1μm 的濾膜；該病毒在 60℃中 0.5h 或者 5080℃ 10min 和 100℃ 5min 可使其完全失去活性。能抵抗的甲醛可使其滅活。 分子生物學研究進展不同毒株在毒力和致病性存在較大差異[9, 11, 19-22]，這促使便更好地控制禽腺病毒引起的疫病。但由于早期缺乏具有組序列信息，無法對其基因組中的編碼區(qū)和非編碼區(qū)進行病毒和哺乳動物腺病毒進行類比鑒定個別基因，但由于沒變或缺失的重組病毒來驗證該突變和缺失對毒力的影響，機理研究也無從談起，從而導致無法深入研究病毒與宿主Nagy 等首次測定了一株非致病性 FAdV-4 毒株 ON1 組 G+C 含量為 54.6%[24]。FAdV-4 毒株 ON1 基因組具有，，在預(yù)測的 46 個 ORFs 中，有 18 個代表禽腺病毒的屬

圖 1-1 21 日齡發(fā)病雞只臨床剖檢和肝臟、心臟 HE 染色結(jié)果Fig. 1-1 Representative postmortem and histological examination of liver and heart from dead bird（a）Accumulation of clear, straw colored fluid in the pericardial sac, and discolored swollen liver with pin pointaemorrhage（b）Small multifocal areas of necrosis and basophilic intranuclear inclusion bodies in hepatocytes（Lymphocytic infiltrates in association with myocarditis.2 Hexon 基因限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析擴增產(chǎn)物經(jīng) 1㳠瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約 900 bp 處有 1 條特異 DNA 條帶。將擴 Hexon 高變區(qū)片段膠回收后分別用 StyI、MluI、BsiwI、BlgI 進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng) 1%糖凝膠電泳檢測，StyI 酶切出 636bp 和 249bp 的短片段；MluI 酶切出 692bp 和 193bp 的段；BsiwI、BglI 酶未切出任何短片段（圖 1-2）。
【學位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.31

【參考文獻】

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本文編號：2646806