【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)世界各國(guó)流行,是養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病之一。其病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)屬于套式病毒目(Nidovirales)動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)成員之一,基因組為單股正鏈RNA,至少具有10個(gè)ORFs,即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7,及ORF5a基因。ORF1編碼所有非結(jié)構(gòu)蛋白,已知有14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1α、Nsp1β、Nsp2-6、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8-12。Nsp2是PRRSV編碼的多功能蛋白,包括半胱氨酸酶區(qū)、高變區(qū)、跨膜區(qū),Nsp2在PRRSV的復(fù)制、致病中具有重要的生物學(xué)意義。本研究開展了2016-2017年間貴州省臨床病料PRRSV NSP2檢測(cè)、分析了2017年臨床毒株GZ-R全長(zhǎng)NSP2序列特征、構(gòu)建了截短N(yùn)SP2的真核表達(dá)載體、分析了截短N(yùn)SP2在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)、初步探索了截短N(yùn)SP2在PRRSV復(fù)制中的作用,旨在為了解我省PRRSV流行情況、探索PRRSV的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。1.PRRSV臨床病例診斷。對(duì)2016-2017年收集的臨床病例樣本進(jìn)行臨床癥狀與剖解觀察、病理組織學(xué)觀察、運(yùn)用世紀(jì)元亨公司的PRRSV檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PRRSV NSP2的RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果送檢病豬主要表現(xiàn)呼吸困難、皮膚發(fā)紺,肺與脾臟組織可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔增厚,肺呈彌漫性間質(zhì)性肺炎。從24份疑似PRRSV病料樣本中,有8份樣本PRRSV NSP2的RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性,陽(yáng)性率為33.3%(8/24)。2.貴州流行PRRSV毒株GZ-R NSP2序列分析。運(yùn)用分子生物學(xué)方法,對(duì)PRRSV陽(yáng)性樣本GZ-R的全長(zhǎng)NSP2進(jìn)行序列擴(kuò)增、TA克隆、測(cè)序,采用DANSar、NCBI在線軟件對(duì)獲得序列進(jìn)行分析。結(jié)果(1)獲得攜帶GZ-R NSP2全長(zhǎng)序列的pMD18T-GZ-R-NSP2-L質(zhì)粒、攜帶GZ-R-NSP2小片段的pMD18T-GZ-R-NSP2-S質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),GZ-R NSP2全長(zhǎng)(GZ-R-NSP2-L)為2980bp,編碼993個(gè)氨基酸;GZ-R NSP2小片段(GZ-R NSP2-S)為1131bp,編碼377個(gè)氨基酸。GZ-R NSP2小片段具有大片段N端1-945bp與C端2795-2980bp序列,缺失GZ-R NSP2大片段的956-2794bp的序列,很可能是一種新的NSP2亞型。(2)GZ-R NSP2全基因氨基酸同源性結(jié)果分析表明,GZ-R株NSP2基因編碼氨基酸與22株參考毒株的同源性為24.3%~99.0%,與美洲性毒株同源性為54.1%~99.0%。GZ-R株NSP2基因與美洲型經(jīng)典代表株ATCC VR-2332同源性分別為77.1%,與我國(guó)高致病性毒株HUN4、JXA1的同源性為98.4%和98.5%,與NJ-1106株的氨基酸序列同源性最高,為99.0%。進(jìn)一步與ATCC VR-2332、CH-1a、HUN4、JXA1毒株進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),GZ-R的NSP2基因的有1+29+1個(gè)氨基酸缺失,缺失位置與高致病性PRRSV JXA1和HUN4的缺失位置一致。3.截短N(yùn)SP2真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)分析。運(yùn)用常規(guī)分子生的學(xué)方法以攜帶NSP2全長(zhǎng)質(zhì)粒pcDNA 3.1-5’Flag-NSP2-TL模板構(gòu)建截短N(yùn)SP2真核表達(dá)質(zhì)粒,采用脂質(zhì)體2000將截短N(yùn)SP2真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK23細(xì)胞,分析截短在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)經(jīng)PCR、測(cè)序、酶切、IFA試驗(yàn)鑒定,成功構(gòu)建了截短N(yùn)sp2的真核表達(dá)載體,pcDNA3.1-NSP2-147~323aa與pcDNA3.1-NSP2-47-323aa;(2)IFA試驗(yàn)結(jié)果表明,無(wú)論用標(biāo)簽Flag抗體還是特異性NSP2單抗均可檢測(cè)到重組蛋白pFlag-Nsp2-147-323aa、pFlag-Nsp2-47-323aa在HEK293細(xì)胞中的表達(dá),pFlag-Nsp2-147-323aa、pFlag-Nsp2-47-323aa在細(xì)胞漿、細(xì)胞核中均有表達(dá)。4.截短N(yùn)sp2在PRRSV復(fù)制中的作用研究。采用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NSP2-147-323aa、pcDNA3.1-NSP2-47-323aa組與空載體轉(zhuǎn)染至Marc145細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后感染PRRSV,感染24 h后收集上清測(cè)TCID50值。結(jié)果pcDNA3.1-NSP2-147-323aa、pcDNA3.1-NSP2-47-323aa組與空載體組的TCID50值差異不顯著。Marc145是PRRSV的易感宿主細(xì)胞,但該細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與表達(dá)效率低可能是造成試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著的原因。
【圖文】：

發(fā)病豬臨床外觀Figure1-1theclinicalappearanceofswine

圖 1-2 發(fā)病豬部分解剖圖Figure 1-2 partial dissection of swine3.3 RT-PCR 結(jié)果以 2016-2017 年間收集到的疑是 PRRSV 24 份病料組織提取總 RNA 作為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，并將反轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，其擴(kuò)增的結(jié)果見(jiàn)下圖。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2646762