【摘要】：流感病毒是引起人類流行性感冒的病原體。近年來隨著流感病毒的流行,新的變異株不斷產(chǎn)生,宿主范圍不斷擴大,病毒的致病性和傳播能力也有不斷增強的趨勢,對公共衛(wèi)生安全的危害日趨嚴重。流感病毒結構簡單,基因組較小,可以通過移碼及可變剪接等方式表達多種蛋白,但在宿主體內(nèi),仍需要借助宿主的蛋白質(zhì)合成及運輸系統(tǒng)、能量系統(tǒng)和可變剪接系統(tǒng)等完成自身的復制。另一方面,流感病毒入侵宿主后,可以被宿主的免疫系統(tǒng)識別,宿主免疫相關蛋白可以通過與病毒蛋白的相互作用,限制流感病毒的復制。由此可見流感病毒與宿主的相互作用是一個非常復雜的過程,深入研究宿主蛋白與流感病毒蛋白的相互作用,對于理解流感病毒的復制機制和致病機理,從而實現(xiàn)流感的有效防控至關重要。流感病毒M2蛋白是一個多功能的蛋白分子,它的離子通道活性可以在病毒復制早期介導病毒脫殼從而使核糖核蛋白復合體(vRNP)具備入核能力,也可以在反式高爾基體中協(xié)助HA蛋白成熟。另外,M2蛋白在病毒復制后期促進子代病毒粒子出芽釋放。鑒于M2蛋白在流感病毒復制周期中具有重要作用,本實驗室前期利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與M2蛋白相互作用的宿主因子,其中之一為Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing proteinα(SGTA)。本研究通過酵母回交驗證表明SGTA蛋白與M2蛋白可以在酵母系統(tǒng)中發(fā)生相互作用,免疫共沉淀實驗證實M2蛋白與SGTA在293T細胞中存在互作,進一步研究發(fā)現(xiàn)SGTA蛋白C端91-313位氨基酸是與M2蛋白互作的關鍵區(qū)域。激光共聚焦實驗結果顯示外源轉(zhuǎn)染的SGTA蛋白和M2蛋白主要共定位于細胞質(zhì)內(nèi)。過表達SGTA蛋白可以促進流感病毒復制,而siRNA下調(diào)SGTA蛋白表達或CRISPR-Cas9敲除SGTA后則顯著抑制流感病毒復制,由此可見,SGTA蛋白對流感病毒復制發(fā)揮正調(diào)控作用。在此基礎上,我們發(fā)現(xiàn)siRNA干擾下調(diào)表達SGTA后不影響病毒NP蛋白進入細胞核,表明SGTA蛋白不影響流感病毒早期復制。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)SGTA蛋白可以增加M2蛋白的穩(wěn)定性,隨著SGTA蛋白轉(zhuǎn)染量的增加M2蛋白表達呈遞增趨勢。本研究部分闡明了宿主蛋白SGTA通過與流感病毒M2蛋白互作正調(diào)控流感病毒復制的機制,豐富了流感病毒與宿主相互作用的網(wǎng)絡。
【圖文】：

驗證 pGBKT7 和 pGADT7，陰性對照組 pGBKT7-Lamin 和 pGADT7和 pGADT7-T 以及重組陽性質(zhì)粒 pGADT7-SGTA 和誘餌質(zhì)粒 pGBY2H Gold 感受態(tài)細胞，并涂在 SD/-2、SD/-4 和 SD/-4/X/A 三種缺驗證。結果顯示，空白對照 pGBKT7 和 pGADT7 與陰性對照 p化后的酵母菌可以在 SD/-2 平板上生長，但不能在 SD/-4 和 SD/-4/照 pGBKT7-p53 和 pGADT7-T 轉(zhuǎn)化后的酵母菌能在 SD/-2、SD/-4正常生長，而且能分解 SD/-4/X/A 缺陷平板上的 X-α-Gal 底物，。重組陽性質(zhì)粒 pGADT7-SGTA 和誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-M2 共轉(zhuǎn)的D/-4/X/A 三種缺陷平板上生長，而且也可以分解 SD/-4/X/A 缺陷平板，與陽性對照組一致（圖 2.1），說明 SGTA 蛋白與 M2 蛋白在酵

科學院碩士學位論文 第二章 宿主蛋白 SGTA 與流感病毒 M2 蛋白相互作疫共沉淀檢測 M2 蛋白與 SGTA 蛋白相互作用 M2 蛋白及 SGTA 蛋白真核表達質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染或共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞，并在轉(zhuǎn)胞，留取對照樣品后，在其余樣品中加入 Flag 抗體進行 IP。結果顯示，F(xiàn)lag-MTA 質(zhì)粒均能正常表達，，而且用 Flag 抗體可以將 SGTA 蛋白 IP 出來（圖 2.2）， SGTA 蛋白在哺乳動物細胞中存在特異性相互作用。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

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本文編號：2646694