【摘要】：流感病毒是引起人類流行性感冒的病原體。近年來隨著流感病毒的流行,新的變異株不斷產(chǎn)生,宿主范圍不斷擴(kuò)大,病毒的致病性和傳播能力也有不斷增強(qiáng)的趨勢(shì),對(duì)公共衛(wèi)生安全的危害日趨嚴(yán)重。流感病毒結(jié)構(gòu)簡單,基因組較小,可以通過移碼及可變剪接等方式表達(dá)多種蛋白,但在宿主體內(nèi),仍需要借助宿主的蛋白質(zhì)合成及運(yùn)輸系統(tǒng)、能量系統(tǒng)和可變剪接系統(tǒng)等完成自身的復(fù)制。另一方面,流感病毒入侵宿主后,可以被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別,宿主免疫相關(guān)蛋白可以通過與病毒蛋白的相互作用,限制流感病毒的復(fù)制。由此可見流感病毒與宿主的相互作用是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,深入研究宿主蛋白與流感病毒蛋白的相互作用,對(duì)于理解流感病毒的復(fù)制機(jī)制和致病機(jī)理,從而實(shí)現(xiàn)流感的有效防控至關(guān)重要。流感病毒M2蛋白是一個(gè)多功能的蛋白分子,它的離子通道活性可以在病毒復(fù)制早期介導(dǎo)病毒脫殼從而使核糖核蛋白復(fù)合體(vRNP)具備入核能力,也可以在反式高爾基體中協(xié)助HA蛋白成熟。另外,M2蛋白在病毒復(fù)制后期促進(jìn)子代病毒粒子出芽釋放。鑒于M2蛋白在流感病毒復(fù)制周期中具有重要作用,本實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與M2蛋白相互作用的宿主因子,其中之一為Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing proteinα(SGTA)。本研究通過酵母回交驗(yàn)證表明SGTA蛋白與M2蛋白可以在酵母系統(tǒng)中發(fā)生相互作用,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)M2蛋白與SGTA在293T細(xì)胞中存在互作,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SGTA蛋白C端91-313位氨基酸是與M2蛋白互作的關(guān)鍵區(qū)域。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示外源轉(zhuǎn)染的SGTA蛋白和M2蛋白主要共定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。過表達(dá)SGTA蛋白可以促進(jìn)流感病毒復(fù)制,而siRNA下調(diào)SGTA蛋白表達(dá)或CRISPR-Cas9敲除SGTA后則顯著抑制流感病毒復(fù)制,由此可見,SGTA蛋白對(duì)流感病毒復(fù)制發(fā)揮正調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上,我們發(fā)現(xiàn)siRNA干擾下調(diào)表達(dá)SGTA后不影響病毒NP蛋白進(jìn)入細(xì)胞核,表明SGTA蛋白不影響流感病毒早期復(fù)制。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)SGTA蛋白可以增加M2蛋白的穩(wěn)定性,隨著SGTA蛋白轉(zhuǎn)染量的增加M2蛋白表達(dá)呈遞增趨勢(shì)。本研究部分闡明了宿主蛋白SGTA通過與流感病毒M2蛋白互作正調(diào)控流感病毒復(fù)制的機(jī)制,豐富了流感病毒與宿主相互作用的網(wǎng)絡(luò)。
【圖文】：

驗(yàn)證 pGBKT7 和 pGADT7，陰性對(duì)照組 pGBKT7-Lamin 和 pGADT7和 pGADT7-T 以及重組陽性質(zhì)粒 pGADT7-SGTA 和誘餌質(zhì)粒 pGBY2H Gold 感受態(tài)細(xì)胞，并涂在 SD/-2、SD/-4 和 SD/-4/X/A 三種缺驗(yàn)證。結(jié)果顯示，空白對(duì)照 pGBKT7 和 pGADT7 與陰性對(duì)照 p化后的酵母菌可以在 SD/-2 平板上生長，但不能在 SD/-4 和 SD/-4/照 pGBKT7-p53 和 pGADT7-T 轉(zhuǎn)化后的酵母菌能在 SD/-2、SD/-4正常生長，而且能分解 SD/-4/X/A 缺陷平板上的 X-α-Gal 底物，。重組陽性質(zhì)粒 pGADT7-SGTA 和誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-M2 共轉(zhuǎn)的D/-4/X/A 三種缺陷平板上生長，而且也可以分解 SD/-4/X/A 缺陷平板，與陽性對(duì)照組一致（圖 2.1），說明 SGTA 蛋白與 M2 蛋白在酵

科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 宿主蛋白 SGTA 與流感病毒 M2 蛋白相互作疫共沉淀檢測(cè) M2 蛋白與 SGTA 蛋白相互作用 M2 蛋白及 SGTA 蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染或共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)胞，留取對(duì)照樣品后，在其余樣品中加入 Flag 抗體進(jìn)行 IP。結(jié)果顯示，F(xiàn)lag-MTA 質(zhì)粒均能正常表達(dá)，，而且用 Flag 抗體可以將 SGTA 蛋白 IP 出來（圖 2.2）， SGTA 蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在特異性相互作用。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2646694